Hvala vam što ste posjetili nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo korištenje najnovije verzije preglednika (ili onemogućavanje načina kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, ova stranica neće sadržavati stilove i JavaScript.
Skeletni mišić je heterogeno tkivo sastavljeno pretežno od miofibrila, koji se kod ljudi obično klasificiraju u tri tipa: jedan "spor" (tip 1) i dva "brza" (tipovi 2A i 2X). Međutim, heterogenost između i unutar tradicionalnih tipova miofibrila ostaje slabo shvaćena. Primijenili smo transkriptomske i proteomske pristupe na 1050, odnosno 1038 pojedinačnih miofibrila iz ljudskog vastus lateralis mišića. Proteomska studija uključivala je muškarce, a transkriptomska studija 10 muškaraca i 2 žene. Pored izoformi teškog lanca miozina, identificirali smo metaboličke proteine, ribosomske proteine i ćelijske spojne proteine kao izvore višedimenzionalne varijabilnosti intermiofibrila. Nadalje, uprkos identifikaciji klastera sporih i brzih vlakana, naši podaci sugeriraju da se vlakna tipa 2X fenotipski ne razlikuju od drugih brzotrzajućih vlakana. Nadalje, klasifikacija zasnovana na teškom lancu miozina nije dovoljna za opis fenotipa miofibrila kod nemalinskih miopatija. Sveukupno, naši podaci ukazuju na višedimenzionalnu heterogenost miofibera, s izvorima varijacija koji se protežu izvan izoformi teškog lanca miozina.
Ćelijska heterogenost je inherentna karakteristika svih bioloških sistema, što omogućava ćelijama da se specijaliziraju kako bi zadovoljile različite potrebe tkiva i ćelija.1 Tradicionalni pogled na heterogenost vlakana skeletnih mišića bio je da motorni neuroni definiraju tip vlakna unutar motorne jedinice i da je tip vlakna (tj. tip 1, tip 2A i tip 2X kod ljudi) određen karakteristikama izoformi teškog lanca miozina (MYH).2 Ovo se u početku zasnivalo na njihovoj nestabilnosti pH ATPaze,3,4 a kasnije na njihovoj molekularnoj ekspresiji MYH.5 Međutim, identifikacijom i naknadnim prihvatanjem „mješovitih“ vlakana koja koeksprimiraju više MYH u različitim omjerima, vlakna skeletnih mišića se sve više posmatraju kao kontinuum, a ne kao zasebni tipovi vlakana.6 Uprkos tome, ovo polje se i dalje uveliko oslanja na MYH kao primarni klasifikator za klasifikaciju miofibera, stav koji je vjerovatno pod utjecajem ograničenja i značajnih pristranosti ranih studija na glodarima čiji se profili ekspresije MYH i raspon tipova vlakana razlikuju od onih kod ljudi.2 Situaciju dodatno komplikuje činjenica da različiti ljudski skeletni mišići pokazuju raznolik raspon tipova vlakana.7 Vastus lateralis je mješoviti mišić sa srednjim (i stoga reprezentativnim) profilom ekspresije MYH.7 Nadalje, lakoća uzorkovanja čini ga najbolje proučenim mišićem kod ljudi.
Stoga je nepristrasno istraživanje raznolikosti vlakana skeletnih mišića korištenjem moćnih "omics" alata ključno, ali i izazovno, dijelom zbog višejezgrene prirode vlakana skeletnih mišića. Međutim, transkriptomske8,9 i proteomske10 tehnologije su posljednjih godina doživjele revoluciju u osjetljivosti zahvaljujući raznim tehnološkim napretcima, omogućavajući analizu skeletnih mišića u rezoluciji pojedinačnih vlakana. Kao rezultat toga, postignut je značajan napredak u karakterizaciji raznolikosti pojedinačnih vlakana i njihovom odgovoru na atrofične podražaje i starenje11,12,13,14,15,16,17,18. Važno je napomenuti da ovi tehnološki napreci imaju kliničku primjenu, omogućavajući detaljniju i precizniju karakterizaciju disregulacije povezane s bolešću. Na primjer, patofiziologija nemalinske miopatije, jedne od najčešćih nasljednih mišićnih bolesti (MIM 605355 i MIM 161800), je složena i zbunjujuća.19,20 Stoga bi bolja karakterizacija disregulacije vlakana skeletnih mišića mogla dovesti do značajnog napretka u našem razumijevanju ove bolesti.
Razvili smo metode za transkriptomsku i proteomsku analizu pojedinačnih vlakana skeletnih mišića ručno izolovanih iz uzoraka ljudske biopsije i primijenili ih na hiljade vlakana, što nam je omogućilo da istražimo ćelijsku heterogenost vlakana skeletnih mišića čovjeka. Tokom ovog rada, demonstrirali smo moć transkriptomskog i proteomskog fenotipiziranja mišićnih vlakana i identificirali metaboličke, ribosomske i ćelijske spojne proteine kao značajne izvore varijabilnosti između vlakana. Nadalje, koristeći ovaj proteomski tijek rada, okarakterizirali smo klinički značaj nematodne miopatije u pojedinačnim vlaknima skeletnih mišića, otkrivajući koordinirani pomak prema neoksidativnim vlaknima neovisno o tipu vlakana na osnovu MYH.
Kako bismo istražili heterogenost ljudskih vlakana skeletnih mišića, razvili smo dva toka rada kako bismo omogućili analizu transkriptoma i proteoma pojedinačnih vlakana skeletnih mišića (Slika 1A i Dopunska slika 1A). Razvili smo i optimizirali nekoliko metodoloških koraka, od pohrane uzoraka i očuvanja integriteta RNK i proteina do optimizacije propusnosti za svaki pristup. Za analizu transkriptoma, ovo je postignuto umetanjem molekularnih barkodova specifičnih za uzorak u početnom koraku reverzne transkripcije, omogućavajući objedinjavanje 96 vlakana za efikasnu naknadnu obradu. Dublje sekvenciranje (±1 milion očitavanja po vlaknu) u poređenju s tradicionalnim pristupima pojedinačnih ćelija dodatno je obogatilo podatke o transkriptomu.21 Za proteomiku smo koristili kratki hromatografski gradijent (21 minuta) u kombinaciji s DIA-PASEF akvizicijom podataka na timsTOF masenom spektrometru kako bismo optimizirali dubinu proteoma uz održavanje visoke propusnosti. 22,23 Kako bismo istražili heterogenost zdravih vlakana skeletnih mišića, okarakterizirali smo transkriptome 1.050 pojedinačnih vlakana od 14 zdravih odraslih donora i proteome 1.038 vlakana od 5 zdravih odraslih donora (Dodatna tabela 1). U ovom radu, ovi skupovi podataka se nazivaju transkriptomi od 1.000 vlakana i proteomi, respektivno. Naš pristup je otkrio ukupno 27.237 transkripata i 2.983 proteina u transkriptomskim i proteomskim analizama od 1.000 vlakana (Slika 1A, Dodatni skupovi podataka 1-2). Nakon filtriranja transkriptomskih i proteomskih skupova podataka za >1.000 detektovanih gena i 50% validnih vrijednosti po vlaknu, naknadne bioinformatičke analize su izvršene za 925 i 974 vlakana u transkriptomu i proteomu, respektivno. Nakon filtriranja, u prosjeku je detektovano 4257 ± 1557 gena i 2015 ± 234 proteina (prosjek ± SD) po vlaknu, sa ograničenom interindividualnom varijabilnosti (Dopunske slike 1B–C, Dopunski skupovi podataka 3–4). Međutim, varijabilnost unutar ispitanika bila je izraženija među učesnicima, vjerovatno zbog razlika u prinosu RNK/proteina između vlakana različitih dužina i površina poprečnog presjeka. Za većinu proteina (>2000), koeficijent varijacije bio je ispod 20% (Dopunska slika 1D). Obje metode su omogućile snimanje širokog dinamičkog raspona transkripata i proteina sa visoko izraženim potpisima važnim za kontrakciju mišića (npr. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Dopunske slike 1E–F). Većina identifikovanih karakteristika bila je zajednička između transkriptomskih i proteomskih skupova podataka (Dopunska slika 1G), a srednji intenziteti UMI/LFQ ovih karakteristika bili su razumno dobro korelirani (r = 0,52) (Dopunska slika 1H).
Tok rada za transkriptomiku i proteomiku (kreiran pomoću BioRender.com). BD Krivulje dinamičkog raspona za MYH7, MYH2 i MYH1, te izračunati pragovi za dodjeljivanje tipa vlakana. E, F Distribucija ekspresije MYH po vlaknima u transkriptomskim i proteomskim skupovima podataka. G, H Grafikoni aproksimacije i projekcije uniformne raznolikosti (UMAP) za transkriptomiku i proteomiku obojeni tipom vlakana zasnovanim na MYH. I, J Karakteristični grafikoni koji prikazuju ekspresiju MYH7, MYH2 i MYH1 u transkriptomskim i proteomskim skupovima podataka.
U početku smo krenuli da svakom vlaknu dodijelimo tip vlakana zasnovan na MYH koristeći optimizovani pristup koji iskorištava visoku osjetljivost i dinamički raspon ekspresije MYH u omics skupovima podataka. Prethodne studije su koristile proizvoljne pragove za označavanje vlakana kao čisti tip 1, tip 2A, tip 2X ili miješani na osnovu fiksnog procenta ekspresije različitih MYH11,14,24. Koristili smo drugačiji pristup u kojem je ekspresija svakog vlakna rangirana prema MYH-ovima koje smo koristili za tipizaciju vlakana: MYH7, MYH2 i MYH1, što odgovara vlaknima tipa 1, tipa 2A i tipa 2X, respektivno. Zatim smo matematički izračunali donju tačku infleksije svake rezultirajuće krivulje i koristili je kao prag za dodjeljivanje vlakana kao pozitivnih (iznad praga) ili negativnih (ispod praga) za svaki MYH (Slika 1B–D). Ovi podaci pokazuju da MYH7 (Slika 1B) i MYH2 (Slika 1C) imaju izraženije on/off profile ekspresije na nivou RNK u poređenju sa nivoom proteina. Zaista, na nivou proteina, vrlo malo vlakana nije eksprimiralo MYH7, a nijedno vlakno nije imalo 100% ekspresiju MYH2. Zatim smo koristili unaprijed određene pragove ekspresije kako bismo svim vlaknima u svakom skupu podataka dodijelili tipove vlakana zasnovane na MYH. Na primjer, vlakna MYH7+/MYH2-/MYH1- su dodijeljena tipu 1, dok su vlakna MYH7-/MYH2+/MYH1+ dodijeljena miješanom tipu 2A/2X (pogledajte Dodatnu tabelu 2 za potpuni opis). Objedinjavanjem svih vlakana, uočili smo izuzetno sličnu distribuciju tipova vlakana zasnovanih na MYH i na nivou RNK (Slika 1E) i proteina (Slika 1F), dok je relativni sastav tipova vlakana zasnovanih na MYH varirao među pojedincima, kao što se i očekivalo (Dodatna slika 2A). Većina vlakana je klasifikovana ili kao čisti tip 1 (34–35%) ili tip 2A (36–38%), iako je detektovan i značajan broj miješanih vlakana tipa 2A/2X (16–19%). Upečatljiva razlika je u tome što se čista vlakna tipa 2X mogu detektovati samo na nivou RNK, ali ne i na nivou proteina, što ukazuje na to da je brza ekspresija MYH barem djelimično regulisana posttranskripcijski.
Validirali smo našu metodu tipizacije MYH vlakana zasnovanu na proteomici koristeći dot blotting na bazi antitijela, i obje metode su postigle 100% slaganje u identifikaciji čistih vlakana tipa 1 i tipa 2A (vidi Dodatnu sliku 2B). Međutim, pristup zasnovan na proteomici bio je osjetljiviji, efikasniji u identifikaciji miješanih vlakana i kvantificiranju udjela svakog MYH gena u svakom vlaknu. Ovi podaci pokazuju učinkovitost korištenja objektivnog, visoko osjetljivog omics pristupa za karakterizaciju tipova vlakana skeletnih mišića.
Zatim smo koristili kombinovane informacije dobijene transkriptomikom i proteomikom kako bismo objektivno klasifikovali miofibre na osnovu njihovog kompletnog transkriptoma ili proteoma. Koristeći metodu uniformne mnogostruke aproksimacije i projekcije (UMAP) za smanjenje dimenzionalnosti na šest glavnih komponenti (Dopunske slike 3A–B), uspjeli smo vizualizovati varijabilnost miofibre u transkriptomu (Slika 1G) i proteomu (Slika 1H). Važno je napomenuti da miofibre nisu grupisane po učesnicima (Dopunske slike 3C–D) ili danima testiranja (Dopunska slika 3E) ni u transkriptomskim ni u proteomskim skupovima podataka, što sugeriše da je varijabilnost unutar ispitanika u skeletnim mišićnim vlaknima veća od varijabilnosti između ispitanika. Na UMAP dijagramu pojavila su se dva različita klastera koja predstavljaju „brza“ i „spora“ miofibre (Slike 1G–H). MYH7+ (spora) miofiberi su bili grupisani na pozitivnom polu UMAP1, dok su MYH2+ i MYH1+ (brza) miofiberi bili grupisani na negativnom polu UMAP1 (Slike 1I–J). Međutim, nije napravljena razlika između tipova vlakana sa brzim kontrahovanjem (tj. tip 2A, tip 2X ili mješoviti 2A/2X) na osnovu ekspresije MYH, što ukazuje na to da ekspresija MYH1 (Slika 1I–J) ili drugih klasičnih 2X miofiber markera kao što su ACTN3 ili MYLK2 (Dopunske slike 4A–B) ne pravi razliku između različitih tipova miofibera kada se razmatra cijeli transkriptom ili proteom. Štaviše, u poređenju sa MYH2 i MYH7, malo transkripata ili proteina je bilo pozitivno korelirano sa MYH1 (Dopunske slike 4C–H), što ukazuje na to da zastupljenost MYH1 ne odražava u potpunosti transkriptom/proteom miofibera. Slični zaključci su postignuti prilikom procjene mješovite ekspresije tri MYH izoforme na UMAP nivou (Dopunske slike 4I–J). Dakle, dok se 2X vlakna mogu identificirati na nivou transkripta samo na osnovu kvantifikacije MYH, MYH1+ vlakna se ne razlikuju od drugih brzih vlakana kada se razmatra cijeli transkriptom ili proteom.
Kao početno istraživanje heterogenosti sporih vlakana izvan MYH, procijenili smo četiri utvrđena proteina specifična za tip sporih vlakana: TPM3, TNNT1, MYL3 i ATP2A22. Podtipovi sporih vlakana pokazali su visoke, iako ne savršene, Pearsonove korelacije s MYH7 i u transkriptomici (Dopunska slika 5A) i u proteomici (Dopunska slika 5B). Približno 25% i 33% sporih vlakana nije klasificirano kao čista spora vlakna od strane svih podtipova gena/proteina u transkriptomici (Dopunska slika 5C) i proteomici (Dopunska slika 5D), respektivno. Stoga, klasifikacija sporih vlakana zasnovana na više podtipova gena/proteina uvodi dodatnu složenost, čak i za proteine za koje se zna da su specifični za tip vlakana. Ovo sugerira da klasifikacija vlakana zasnovana na izoformama jedne porodice gena/proteina možda ne odražava adekvatno pravu heterogenost vlakana skeletnih mišića.
Kako bismo dalje istražili fenotipsku varijabilnost ljudskih skeletnih mišićnih vlakana na skali cijelog omics modela, izvršili smo nepristrasnu redukciju dimenzionalnosti podataka korištenjem analize glavnih komponenti (PCA) (Slika 2A). Slično UMAP dijagramima, ni učesnik ni dan testiranja nisu utjecali na grupiranje vlakana na PCA nivou (Dopunske slike 6A–C). U oba seta podataka, tip vlakana zasnovan na MYH objašnjen je pomoću PC2, koji je pokazao klaster sporotrzajnih vlakana tipa 1 i drugi klaster koji sadrži brzotrzajna vlakna tipa 2A, tipa 2X i mješovita 2A/2X vlakna (Slika 2A). U oba seta podataka, ova dva klastera bila su povezana malim brojem mješovitih vlakana tipa 1/2A. Kao što se i očekivalo, analiza prekomjerne zastupljenosti glavnih PC pokretača potvrdila je da je PC2 pokretan kontraktilnim i metaboličkim potpisima (Slika 2B i Dopunske slike 6D–E, Dopunski skupovi podataka 5–6). Sveukupno, utvrđeno je da je tip vlakana zasnovan na MYH dovoljan da objasni kontinuiranu varijaciju duž PC2, s izuzetkom takozvanih 2X vlakana koja su raspoređena po cijelom transkriptomu unutar brzog klastera.
A. Grafikoni analize glavnih komponenti (PCA) skupova podataka transkriptoma i proteoma obojeni prema tipu vlakna na osnovu MYH. B. Analiza obogaćivanja transkriptnih i proteinskih drajvera u PC2 i PC1. Statistička analiza je izvršena korištenjem clusterProfiler paketa i p-vrijednosti prilagođenih Benjamini-Hochbergu. C, D. PCA grafikoni obojeni prema terminima ontologije gena (GO) međućelijske adhezije u transkriptomu i GO terminima kostamera u proteomu. Strelice predstavljaju transkriptne i proteinske drajvere i njihove smjerove. E, F. Grafikoni uniformne mnogostruke aproksimacije i projekcije (UMAP) prikazuju klinički relevantne karakteristike koje prikazuju gradijente ekspresije neovisno o tipu sporih/brzih vlakana. G, H. Korelacije između PC2 i PC1 drajvera u transkriptomima i proteomima.
Neočekivano, tip miofibera zasnovan na MYH objasnio je samo drugi najveći stepen varijabilnosti (PC2), što sugerira da drugi biološki faktori koji nisu povezani s tipom miofibera zasnovanim na MYH (PC1) igraju važnu ulogu u regulaciji heterogenosti vlakana skeletnih mišića. Analiza prekomjerne zastupljenosti glavnih pokretača u PC1 otkrila je da je varijabilnost u PC1 prvenstveno određena adhezijom ćelija-ćelija i sadržajem ribosoma u transkriptomu, te kostamerama i ribosomskim proteinima u proteomu (Slika 2B i Dopunske slike 6D-E, Dopunski skup podataka 7). U skeletnim mišićima, kostamere povezuju Z-disk sa sarkolemom i uključene su u prijenos sile i signalizaciju. 25 Anotirani PCA grafikoni korištenjem karakteristika adhezije ćelija-ćelija (transkriptom, Slika 2C) i kostamera (proteom, Slika 2D) otkrili su snažan pomak ulijevo u PC1, što ukazuje na to da su ove karakteristike obogaćene određenim vlaknima.
Detaljnijim ispitivanjem grupisanja miofibera na UMAP nivou otkriveno je da većina karakteristika pokazuje gradijent ekspresije zasnovan na MYH-u, neovisan o tipu miofibera, a ne specifičan za podgrupe miofibera. Ovaj kontinuitet je uočen kod nekoliko gena povezanih s patološkim stanjima (Slika 2E), kao što su CHCHD10 (neuromuskularna bolest), SLIT3 (atrofija mišića), CTDNEP1 (bolest mišića). Ovaj kontinuitet je također uočen u cijelom proteomu, uključujući proteine povezane s neurološkim poremećajima (UGDH), inzulinskom signalizacijom (PHIP) i transkripcijom (HIST1H2AB) (Slika 2F). Zajedno, ovi podaci ukazuju na kontinuitet u heterogenosti sporog/brzog trzaja, neovisnoj o tipu vlakana, u različitim miofiberima.
Zanimljivo je da su upravljački geni u PC2 pokazali dobru korelaciju transkriptoma i proteoma (r = 0,663) (Slika 2G), što ukazuje na to da su tipovi vlakana sa sporim i brzim trzajem, a posebno kontraktilna i metabolička svojstva vlakana skeletnih mišića, transkripcijski regulisani. Međutim, upravljački geni u PC1 nisu pokazali korelaciju transkriptoma i proteoma (r = -0,027) (Slika 2H), što ukazuje na to da su varijacije koje nisu povezane sa tipovima vlakana sa sporim/brzim trzajem uglavnom regulisane posttranskripcijski. Budući da su varijacije u PC1 prvenstveno objašnjene terminima ontologije ribosomskih gena, i s obzirom na to da ribosomi igraju ključnu i specijaliziranu ulogu u ćeliji aktivnim učešćem i uticajem na translaciju proteina,31 zatim smo krenuli u istraživanje ove neočekivane heterogenosti ribosoma.
Prvo smo obojili grafik proteomske analize glavnih komponenti prema relativnoj zastupljenosti proteina u GOCC terminu "citoplazmatski ribosom" (Slika 3A). Iako je ovaj termin obogaćen na pozitivnoj strani PC1, što rezultira malim gradijentom, ribosomski proteini pokreću particioniranje u oba smjera PC1 (Slika 3A). Ribosomski proteini obogaćeni na negativnoj strani PC1 uključivali su RPL18, RPS18 i RPS13 (Slika 3B), dok su RPL31, RPL35 i RPL38 (Slika 3C) bili glavni pokretači na pozitivnoj strani PC1. Zanimljivo je da su RPL38 i RPS13 bili visoko eksprimirani u skeletnim mišićima u poređenju s drugim tkivima (Dopunska slika 7A). Ovi prepoznatljivi ribosomski potpisi u PC1 nisu uočeni u transkriptomu (Dopunska slika 7B), što ukazuje na posttranskripcijsku regulaciju.
A. Grafik analize glavnih komponenti (PCA) obojen prema terminima citoplazmatske ribosomske genske ontologije (GO) preko proteoma. Strelice pokazuju smjer varijacija posredovanih proteinima na PCA grafikonu. Dužina linije odgovara rezultatu glavne komponente za dati protein. B, C. PCA karakteristični grafikoni za RPS13 i RPL38. D. Nenadzirana hijerarhijska analiza klasteriranja citoplazmatskih ribosomskih proteina. E. Strukturni model 80S ribosoma (PDB: 4V6X) koji ističe ribosomske proteine s različitom zastupljenošću u vlaknima skeletnih mišića. F. Ribosomski proteini s različitom stehiometrijom lokalizirani u blizini izlaznog kanala mRNA.
Koncepti ribosomske heterogenosti i specijalizacije su prethodno predloženi, pri čemu prisustvo različitih subpopulacija ribosoma (ribosomska heterogenost) može direktno uticati na translaciju proteina u različitim tkivima32 i ćelijama33 putem selektivne translacije specifičnih skupova mRNA transkripata34 (specijalizacija ribosoma). Da bismo identifikovali subpopulacije ribosomskih proteina koji se koeksprimiraju u vlaknima skeletnih mišića, izvršili smo nenadziranu hijerarhijsku analizu klasterovanja ribosomskih proteina u proteomu (Slika 3D, Dopunski skup podataka 8). Kao što se i očekivalo, ribosomski proteini se nisu grupisali po tipu vlakana na osnovu MYH. Međutim, identifikovali smo tri različita klastera ribosomskih proteina; prvi klaster (ribosomski_klaster_1) je koregulisan sa RPL38 i stoga ima povećanu ekspresiju u vlaknima sa pozitivnim PC1 profilom. Drugi klaster (ribosomski_klaster_2) je koregulisan sa RPS13 i povišen je u vlaknima sa negativnim PC1 profilom. Treći klaster (ribosomski_klaster_3) ne pokazuje koordinisanu diferencijalnu ekspresiju u vlaknima skeletnih mišića i može se smatrati "jezgrom" ribosomskog proteina skeletnih mišića. Oba ribosomska klastera 1 i 2 sadrže ribosomske proteine za koje je prethodno pokazano da regulišu alternativnu translaciju (npr. RPL10A, RPL38, RPS19 i RPS25) i funkcionalno utiču na razvoj (npr. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 U skladu s rezultatima PCA, uočena heterogena zastupljenost ovih ribosomskih proteina u vlaknima također je pokazala kontinuitet (Dopunska slika 7C).
Da bismo vizualizirali lokaciju heterogenih ribosomskih proteina unutar ribosoma, koristili smo strukturni model ljudskog 80S ribosoma (Protein Data Bank: 4V6X) (Slika 3E). Nakon izolacije ribosomskih proteina koji pripadaju različitim ribosomskim klasterima, njihove lokacije nisu bile usko poravnate, što ukazuje na to da naš pristup nije uspio osigurati obogaćivanje određenih regija/frakcija ribosoma. Međutim, zanimljivo je da je udio proteina velikih podjedinica u klasteru 2 bio niži nego u klasterima 1 i 3 (Dopunska slika 7D). Primijetili smo da su proteini s promijenjenom stehiometrijom u vlaknima skeletnih mišića pretežno lokalizirani na površini ribosoma (Slika 3E), što je u skladu s njihovom sposobnošću interakcije s elementima internog mjesta ulaska ribosoma (IRES) u različitim populacijama mRNA, čime koordiniraju selektivnu translaciju. 40, 41 Nadalje, mnogi proteini s promijenjenom stehiometrijom u vlaknima skeletnih mišića bili su smješteni u blizini funkcionalnih regija kao što je izlazni tunel mRNA (Slika 3F), koji selektivno reguliraju translacijsko izduženje i zaustavljanje specifičnih peptida. 42 Ukratko, naši podaci ukazuju na to da stehiometrija ribosomskih proteina skeletnih mišića pokazuje heterogenost, što rezultira razlikama između vlakana skeletnih mišića.
Zatim smo krenuli u identifikaciju potpisa brzih i sporih vlakana i istraživanje mehanizama njihove transkripcijske regulacije. Upoređujući klastere brzih i sporih vlakana definisanih UMAP-om u dva seta podataka (Slike 1G–H i 4A–B), transkriptomske i proteomske analize su identifikovale 1366, odnosno 804 različito zastupljene karakteristike (Slike 4A–B, Dopunski setovi podataka 9–12). Uočili smo očekivane razlike u potpisima vezanim za sarkomere (npr. tropomiozin i troponin), spajanje ekscitacije i kontrakcije (SERCA izoforme) i metabolizam energije (npr. ALDOA i CKB). Štaviše, transkripti i proteini koji regulišu ubikvitinaciju proteina bili su različito eksprimirani u brzim i sporim vlaknima (npr. USP54, SH3RF2, USP28 i USP48) (Slike 4A–B). Štaviše, gen mikrobnog proteina RP11-451G4.2 (DWORF), za koji je prethodno pokazano da se diferencijalno eksprimira u različitim tipovima mišićnih vlakana janjetine43 i pojačava aktivnost SERCA u srčanom mišiću44, bio je značajno pojačan u sporim vlaknima skeletnih mišića (Slika 4A). Slično tome, na nivou pojedinačnih vlakana, uočene su značajne razlike u poznatim potpisima kao što su izoforme laktat dehidrogenaze povezane s metabolizmom (LDHA i LDHB, Slika 4C i Dopunska slika 8A)45,46, kao i prethodno nepoznati potpisi specifični za tip vlakana (kao što su IRX3, USP54, USP28 i DPYSL3) (Slika 4C). Postojalo je značajno preklapanje diferencijalno eksprimiranih karakteristika između transkriptomskih i proteomskih skupova podataka (Dopunska slika 8B), kao i korelacija promjene nagiba uzrokovana uglavnom izraženijom diferencijalnom ekspresijom karakteristika sarkomera (Dopunska slika 8C). Značajno je da su neki potpisi (npr. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) pokazali snažnu posttranskripcijsku regulaciju samo na proteomskom nivou i imali su specifične profile ekspresije za tip sporih/brzih vlakana (Dopunska slika 8C).
A i B vulkanski dijagrami koji upoređuju spore i brze klastere identifikovane dijagramima uniformne mnogostruke aproksimacije i projekcije (UMAP) na slikama 1G–H. Obojene tačke predstavljaju transkripte ili proteine koji se značajno razlikuju pri FDR < 0,05, a tamnije tačke predstavljaju transkripte ili proteine koji se značajno razlikuju pri logaritamskoj promjeni > 1. Dvosmjerna statistička analiza izvršena je korištenjem DESeq2 Wald testa sa Benjamini-Hochberg prilagođenim p-vrijednostima (transkriptomika) ili Limma metodom linearnog modela sa empirijskom Bayesovom analizom nakon čega slijedi Benjamini-Hochberg prilagođavanje za višestruka poređenja (proteomika). C Grafikoni potpisa odabranih različito eksprimiranih gena ili proteina između sporih i brzih vlakana. D Analiza obogaćivanja značajno različito eksprimiranih transkripata i proteina. Vrijednosti koje se preklapaju su obogaćene u oba skupa podataka, vrijednosti transkriptoma su obogaćene samo u transkriptomu, a vrijednosti proteoma su obogaćene samo u proteomu. Statistička analiza je izvršena korištenjem clusterProfiler paketa sa Benjamini-Hochberg prilagođenim p-vrijednostima. E. Transkripcijski faktori specifični za tip vlakana koje je identificirao SCENIC na osnovu rezultata specifičnosti regulatora izvedenih iz SCENIC-a i diferencijalne ekspresije mRNA između tipova vlakana. F. Profiliranje odabranih transkripcijskih faktora diferencijalno eksprimiranih između sporih i brzih vlakana.
Zatim smo izvršili analizu prekomjerne zastupljenosti različito zastupljenih gena i proteina (Slika 4D, Dodatni skup podataka 13). Obogaćivanje puta za karakteristike koje su se razlikovale između dva skupa podataka otkrilo je očekivane razlike, kao što su procesi β-oksidacije masnih kiselina i metabolizma ketona (spora vlakna), kontrakcija miofilamenata/mišića (brza i spora vlakna, respektivno) i katabolički procesi ugljikohidrata (brza vlakna). Aktivnost serin/treonin protein fosfataze također je bila povišena u brzim vlaknima, potaknuta karakteristikama kao što su regulatorne i katalitičke podjedinice fosfataze (PPP3CB, PPP1R3D i PPP1R3A), za koje se zna da regulišu metabolizam glikogena (47) (Dodatne slike 8D–E). Drugi putevi obogaćeni brzim vlaknima uključivali su tijela za obradu (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) u proteomu (Dopunska slika 8F), potencijalno uključena u post-transkripcijsku regulaciju (48), i aktivnost transkripcijskih faktora (SREBF1, RXRG, RORA) u transkriptomu (Dopunska slika 8G). Spora vlakna su bila obogaćena aktivnošću oksidoreduktaze (BDH1, DCXR, TXN2) (Dopunska slika 8H), vezivanjem amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Dopunska slika 8I), ekstracelularnim matriksom (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Dopunska slika 8J) i aktivnošću receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Dopunska slika 8K).
Kako bismo stekli dublji uvid u transkripcijsku regulaciju koja leži u osnovi karakteristika tipova sporih/brzih mišićnih vlakana, izvršili smo analizu obogaćivanja transkripcijskih faktora koristeći SCENIC49 (Dodatni skup podataka 14). Mnogi transkripcijski faktori su značajno obogaćeni između brzih i sporih mišićnih vlakana (Slika 4E). To je uključivalo transkripcijske faktore kao što je MAFA, koji je prethodno povezan s razvojem brzih mišićnih vlakana,50 kao i nekoliko transkripcijskih faktora koji ranije nisu bili povezani s genskim programima specifičnim za tip mišićnih vlakana. Među njima, PITX1, EGR1 i MYF6 bili su najobogaćeniji transkripcijski faktori u brzim mišićnim vlaknima (Slika 4E). Nasuprot tome, ZSCAN30 i EPAS1 (također poznat kao HIF2A) bili su najobogaćeniji transkripcijski faktori u sporim mišićnim vlaknima (Slika 4E). U skladu s tim, MAFA je eksprimiran na višim nivoima u UMAP regiji koja odgovara brzim mišićnim vlaknima, dok je EPAS1 imao suprotan obrazac ekspresije (Slika 4F).
Pored poznatih gena koji kodiraju proteine, postoje brojni biotipovi nekodirajućih RNK koji mogu biti uključeni u regulaciju ljudskog razvoja i bolesti. 51, 52 U transkriptomskim skupovima podataka, nekoliko nekodirajućih RNK pokazuje specifičnost za tip vlakana (Slika 5A i Dopunski skup podataka 15), uključujući LINC01405, koja je visoko specifična za spora vlakna i za koju se navodi da je smanjena u mišićima kod pacijenata s mitohondrijalnom miopatijom. 53 Nasuprot tome, RP11-255P5.3, koji odgovara genu lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, pokazuje specifičnost za tip brzih vlakana. I LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) i RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) pokazuju specifičnost za skeletne mišiće (Dopunske slike 9A–B) i nemaju poznate kontraktilne gene unutar svog genomskog susjedstva od 1 Mb, što ukazuje na to da igraju specijaliziranu ulogu u regulaciji tipova vlakana, a ne u regulaciji susjednih kontraktilnih gena. Profili ekspresije specifični za spore/brze tipove vlakana LINC01405 i RP11-255P5.3, respektivno, potvrđeni su korištenjem RNAscope-a (Slike 5B–C).
A. Nekodirajući RNK transkripti su značajno regulirani u sporim i brzim mišićnim vlaknima. B. Reprezentativne RNKskop slike koje prikazuju specifičnost tipova sporih i brzih vlakana LINC01405 i RP11-255P5.3, respektivno. Mjerna skala = 50 μm. C. Kvantifikacija ekspresije nekodirajuće RNK specifične za tip miofibera, određena RNKskopom (n = 3 biopsije od nezavisnih pojedinaca, upoređujući brza i spora mišićna vlakna unutar svake osobe). Statistička analiza je izvršena korištenjem dvostranog Studentovog t-testa. Box dijagrami prikazuju medijanu i prvi i treći kvartil, s viskijima koji pokazuju na minimalne i maksimalne vrijednosti. D. De novo tijek rada za identifikaciju mikrobnih proteina (kreiran pomoću BioRender.com). E. Mikrobni protein LINC01405_ORF408:17441:17358 je specifično eksprimiran u sporim skeletnim mišićnim vlaknima (n = 5 biopsija od nezavisnih učesnika, upoređujući brza i spora mišićna vlakna kod svakog učesnika). Statistička analiza je provedena korištenjem Limmove metode linearnog modela u kombinaciji s empirijskim Bayesovim pristupom, nakon čega je uslijedila Benjamini-Hochbergova metoda za višestruka poređenja s prilagođavanjem p-vrijednosti. Box dijagrami prikazuju medijanu, prvi i treći kvartil, s viskijima koji pokazuju na maksimalne/minimalne vrijednosti.
Nedavne studije su pokazale da mnogi pretpostavljeni nekodirajući transkripti kodiraju transkribirane mikrobne proteine, od kojih neki regulišu funkciju mišića. 44, 55 Kako bismo identificirali mikrobne proteine s potencijalnom specifičnošću za tip vlakana, pretražili smo naš skup podataka od 1000 proteoma vlakana koristeći prilagođenu FASTA datoteku koja sadrži sekvence nekodirajućih transkripata (n = 305) pronađenih u skupu podataka od 1000 transkriptoma vlakana (Slika 5D). Identificirali smo 197 mikrobnih proteina iz 22 različita transkripta, od kojih je 71 različito reguliran između sporih i brzih vlakana skeletnih mišića (Dopunska slika 9C i Dopunski skup podataka 16). Za LINC01405 identificirana su tri produkta mikrobnih proteina, od kojih je jedan pokazao sličnu specifičnost za spora vlakna kao i njegov transkript (Slika 5E i Dopunska slika 9D). Stoga smo identificirali LINC01405 kao gen koji kodira mikrobni protein specifičan za spora vlakna skeletnih mišića.
Razvili smo sveobuhvatan tijek rada za proteomsku karakterizaciju pojedinačnih mišićnih vlakana velikih razmjera i identificirali regulatore heterogenosti vlakana u zdravim stanjima. Primijenili smo ovaj tijek rada kako bismo razumjeli kako nemalinske miopatije utječu na heterogenost vlakana skeletnih mišića. Nemalinske miopatije su nasljedne mišićne bolesti koje uzrokuju slabost mišića i, kod pogođene djece, prezentiraju se nizom komplikacija, uključujući respiratorne tegobe, skoliozu i ograničenu pokretljivost udova. 19,20 Tipično, kod nemalinskih miopatija, patogene varijante u genima kao što je aktin alfa 1 (ACTA1) rezultiraju predominacijom sastava miofibrila sa sporim trzanjem, iako je ovaj učinak heterogen. Jedan značajan izuzetak je troponin T1 nemalinska miopatija (TNNT1), koja ima predominaciju brzih vlakana. Stoga, bolje razumijevanje heterogenosti koja leži u osnovi disregulacije vlakana skeletnih mišića uočene kod nemalinskih miopatija može pomoći u razotkrivanju složenog odnosa između ovih bolesti i tipa miofibrila.
U poređenju sa zdravim kontrolnim grupama (n=3 po grupi), miofibrile izolovane od pacijenata sa nemalinskom miopatijom sa mutacijama u genima ACTA1 i TNNT1 pokazale su izraženu atrofiju ili distrofiju miofibrila (Slika 6A, Dodatna tabela 3). Ovo je predstavljalo značajne tehničke izazove za proteomsku analizu zbog ograničene količine dostupnog materijala. Uprkos tome, uspjeli smo detektovati 2485 proteina u 272 skeletna miofibrila. Nakon filtriranja najmanje 1000 kvantifikovanih proteina po vlaknu, 250 vlakana je podvrgnuto naknadnoj bioinformatičkoj analizi. Nakon filtriranja, kvantifikovano je u prosjeku 1573 ± 359 proteina po vlaknu (Dodatna slika 10A, Dodatni skupovi podataka 17–18). Značajno je da je, uprkos značajnom smanjenju veličine vlakana, dubina proteoma uzoraka pacijenata sa nemalinskom miopatijom samo blago smanjena. Štaviše, obrada ovih podataka korištenjem naših vlastitih FASTA datoteka (uključujući nekodirajuće transkripte) omogućila nam je da identificiramo pet mikrobnih proteina u skeletnim miofibrima pacijenata s nemalinskom miopatijom (Dodatni skup podataka 19). Dinamički raspon proteoma bio je značajno širi, a ukupni proteini u kontrolnoj grupi dobro su korelirali s rezultatima prethodne analize proteoma sa 1000 vlakana (Dodatna slika 10B–C).
A. Mikroskopske slike koje prikazuju atrofiju ili distrofiju vlakana i predominaciju različitih tipova vlakana na osnovu MYH kod ACTA1 i TNNT1 nemalinskih miopatija (NM). Mjerna traka = 100 μm. Da bi se osigurala ponovljivost bojenja kod ACTA1 i TNNT1 pacijenata, tri biopsije pacijenata su obojene dva do tri puta (četiri presjeka po slučaju) prije odabira reprezentativnih slika. B. Proporcije tipova vlakana kod učesnika na osnovu MYH. C. Grafik analize glavnih komponenti (PCA) skeletnih mišićnih vlakana kod pacijenata sa nemalinskim miopatijama i kontrolne grupe. D. Skeletna mišićna vlakna pacijenata sa nemalinskim miopatijama i kontrolne grupe projektovana na PCA grafik određen na osnovu 1000 analiziranih vlakana na Slici 2. Na primjer, vulkanski dijagrami koji upoređuju razlike između učesnika sa ACTA1 i TNNT1 nemalinskim miopatijama i kontrolne grupe, te između učesnika sa ACTA1 i TNNT1 nemalinskim miopatijama. Obojeni krugovi označavaju proteine koji su se značajno razlikovali pri π < 0,05, a tamne tačke označavaju proteine koji su se značajno razlikovali pri FDR < 0,05. Statistička analiza je provedena korištenjem Limma metode linearnog modela i empirijskih Bayesovih metoda, nakon čega je uslijedilo prilagođavanje p-vrijednosti za višestruka poređenja korištenjem Benjamini-Hochberg metode. H. Analiza obogaćivanja značajno različito eksprimiranih proteina u cijelom proteomu i u vlaknima tipa 1 i 2A. Statistička analiza je provedena korištenjem clusterProfiler paketa i Benjamini-Hochberg prilagođenih p-vrijednosti. I, J. Grafikoni analize glavnih komponenti (PCA) obojeni terminima ekstracelularnog matriksa i mitohondrijske genske ontologije (GO).
Budući da nemalinske miopatije mogu utjecati na udio tipova miofibera koji eksprimiraju MYH u skeletnim mišićima,19,20 prvo smo ispitali tipove miofibera koji eksprimiraju MYH kod pacijenata s nemalinskim miopatijama i kontrolne grupe. Tip miofibera odredili smo koristeći nepristrasnu metodu koja je prethodno opisana za test od 1000 miofibera (Dopunske slike 10D-E) i ponovo nismo uspjeli identificirati čiste 2X miofibere (Slika 6B). Uočili smo heterogeni učinak nemalinskih miopatija na tip miofibera, jer su dva pacijenta s ACTA1 mutacijama imala povećan udio miofibera tipa 1, dok su dva pacijenta s TNNT1 nemalinskom miopatijom imala smanjen udio miofibera tipa 1 (Slika 6B). Zaista, ekspresija MYH2 i izoformi brzih troponina (TNNC2, TNNI2 i TNNT3) bila je smanjena kod ACTA1-nemalinskih miopatija, dok je ekspresija MYH7 bila smanjena kod TNNT1-nemalinskih miopatija (Dodatna slika 11A). Ovo je u skladu s prethodnim izvještajima o heterogenoj promjeni tipa miofibera kod nemalinskih miopatija.19,20 Potvrdili smo ove rezultate imunohistokemijom i otkrili da su pacijenti s ACTA1-nemalinskom miopatijom imali predominaciju miofibera tipa 1, dok su pacijenti s TNNT1-nemalinskom miopatijom imali suprotan obrazac (Slika 6A).
Na nivou proteoma pojedinačnih vlakana, vlakna skeletnih mišića pacijenata sa ACTA1 i TNNT1 nemalinskom miopatijom grupisana su s većinom kontrolnih vlakana, pri čemu su vlakna TNNT1 nemalinske miopatije uglavnom bila najteže pogođena (Slika 6C). Ovo je bilo posebno očigledno prilikom crtanja dijagrama pseudo-napuhanih vlakana pomoću analize glavnih komponenti (PCA) za svakog pacijenta, pri čemu su pacijenti 2 i 3 sa TNNT1 nemalinskom miopatijom izgledali najudaljenije od kontrolnih uzoraka (Dopunska slika 11B, Dopunski skup podataka 20). Da bismo bolje razumjeli kako se vlakna pacijenata sa miopatijom porede sa zdravim vlaknima, koristili smo detaljne informacije dobijene proteomskom analizom 1.000 vlakana od zdravih odraslih učesnika. Projektovali smo vlakna iz skupa podataka o miopatiji (pacijenti i kontrolna grupa sa ACTA1 i TNNT1 nemalinskom miopatijom) na PCA dijagram dobijen proteomskom analizom 1000 vlakana (Slika 6D). Distribucija tipova MYH vlakana duž PC2 u kontrolnim vlaknima bila je slična distribuciji vlakana dobijenoj proteomskom analizom 1000 vlakana. Međutim, većina vlakana kod pacijenata s nemalinskom miopatijom pomaknula se niz PC2, preklapajući se sa zdravim brzotrzajnim vlaknima, bez obzira na njihov prirodni MYH tip vlakana. Dakle, iako su pacijenti s ACTA1 nemalinskom miopatijom pokazali pomak prema vlaknima tipa 1 kada su kvantificirani korištenjem MYH-baziranih metoda, i ACTA1 nemalinska miopatija i TNNT1 nemalinska miopatija pomaknule su proteom skeletnih mišićnih vlakana prema brzotrzajnim vlaknima.
Zatim smo direktno uporedili svaku grupu pacijenata sa zdravim kontrolnim grupama i identificirali 256 i 552 različito eksprimirana proteina kod ACTA1 i TNNT1 nemalinskih miopatija, respektivno (Slika 6E–G i Dopunska slika 11C, Dopunski skup podataka 21). Analiza obogaćivanja gena otkrila je koordinirano smanjenje mitohondrijskih proteina (Slika 6H–I, Dopunski skup podataka 22). Iznenađujuće, uprkos različitoj predominaciji tipova vlakana kod ACTA1 i TNNT1 nemalinskih miopatija, ovo smanjenje je bilo potpuno nezavisno od tipa vlakana zasnovanog na MYH (Slika 6H i Dopunske slike 11D–I, Dopunski skup podataka 23). Tri mikrobna proteina su također bila regulirana kod ACTA1 ili TNNT1 nemalinskih miopatija. Dva od ovih mikroproteina, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (također poznat kao LINC00598 ili Lnc-FOXO1) i ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), pokazali su različitu zastupljenost samo u miofibrima tipa 1. Prethodno je objavljeno da ENSG00000215483_TR14_ORF67 igra ulogu u regulaciji ćelijskog ciklusa. 56 S druge strane, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (koji odgovara LINC01798) bio je povećan u miofibrima i tipa 1 i tipa 2A kod ACTA1-nemalinske miopatije u poređenju sa zdravim kontrolama (Dopunska slika 12A, Dopunski skup podataka 24). Nasuprot tome, ribosomski proteini nisu bili uglavnom pogođeni nemalinskom miopatijom, iako je RPS17 bio smanjen kod ACTA1 nemalinske miopatije (slika 6E).
Analiza obogaćivanja također je otkrila pojačanu regulaciju procesa imunološkog sistema kod ACTA1 i TNNT1 nemalinskih miopatija, dok je adhezija ćelija također bila povećana kod TNNT1 nemalinske miopatije (Slika 6H). Obogaćivanje ovih ekstracelularnih faktora odrazilo se na pomicanje ekstracelularnih proteina matriksa PCA u PC1 i PC2 u negativnom smjeru (tj. prema najviše pogođenim vlaknima) (Slika 6J). Obje grupe pacijenata pokazale su povećanu ekspresiju ekstracelularnih proteina uključenih u imunološke odgovore i mehanizme popravke sarkoleme, kao što su aneksini (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 i njihov interagirajući protein S100A1159 (Dopunske slike 12B-C). Ranije je objavljeno da je ovaj proces pojačan kod mišićnih distrofija60, ali, koliko znamo, ranije nije bio povezan s nemalinskim miopatijama. Normalna funkcija ovog molekularnog mehanizma potrebna je za popravak sarkoleme nakon povrede i za fuziju novostvorenih miocita s miofibrilima58,61. Dakle, povećana aktivnost ovog procesa u obje grupe pacijenata ukazuje na reparativni odgovor na povredu uzrokovanu nestabilnošću miofibera.
Efekti svake nemalinske miopatije bili su dobro korelirani (r = 0,736) i pokazali su razumno preklapanje (Dopunske slike 11A–B), što ukazuje da ACTA1 i TNNT1 nemalinska miopatija imaju slične efekte na proteom. Međutim, neki proteini su bili regulirani samo kod ACTA1 ili TNNT1 nemalinske miopatije (Dopunske slike 11A i C). Profibrotični protein MFAP4 bio je jedan od najreguliranijih proteina kod TNNT1 nemalinske miopatije, ali je ostao nepromijenjen kod ACTA1 nemalinske miopatije. SKIC8, komponenta PAF1C kompleksa odgovorna za regulaciju transkripcije HOX gena, bila je smanjena kod TNNT1 nemalinske miopatije, ali nije bila pogođena kod ACTA1 nemalinske miopatije (Dopunska slika 11A). Direktno poređenje ACTA1 i TNNT1 nemalinske miopatije otkrilo je veće smanjenje mitohondrijskih proteina i povećanje proteina imunološkog sistema kod TNNT1 nemalinske miopatije (Slika 6G–H i Dodatne slike 11C i 11H–I). Ovi podaci su u skladu s većom atrofijom/distrofijom uočenom kod TNNT1 nemalinske miopatije u poređenju sa TNNT1 nemalinskom miopatijom (Slika 6A), što sugerira da TNNT1 nemalinska miopatija predstavlja teži oblik bolesti.
Kako bismo procijenili da li uočeni efekti nemalinske miopatije perzistiraju na nivou cijelog mišića, izvršili smo skupnu proteomsku analizu mišićnih biopsija iste kohorte pacijenata sa TNNT1 nemalinskom miopatijom i uporedili ih sa kontrolnom grupom (n=3 po grupi) (Dopunska slika 13A, Dopunski skup podataka 25). Kao što se i očekivalo, kontrolne grupe su bile blisko povezane u analizi glavnih komponenti, dok su pacijenti sa TNNT1 nemalinskom miopatijom pokazali veću varijabilnost među uzorcima, sličnu onoj uočenoj u analizi pojedinačnih vlakana (Dopunska slika 13B). Skupna analiza je reproducirala različito eksprimirane proteine (Dopunska slika 13C, Dopunski skup podataka 26) i biološke procese (Dopunska slika 13D, Dopunski skup podataka 27) istaknute poređenjem pojedinačnih vlakana, ali je izgubila sposobnost razlikovanja različitih tipova vlakana i nije uspjela uzeti u obzir heterogene efekte bolesti na različitim vlaknima.
Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da proteomika pojedinačnih miofibera može razjasniti kliničke biološke karakteristike koje se ne mogu otkriti ciljanim metodama kao što je imunobloting. Štaviše, ovi podaci ističu ograničenja korištenja samo tipizacije aktinskih vlakana (MYH) za opis fenotipske adaptacije. Zaista, iako se promjena tipa vlakana razlikuje između aktinskih i troponin nemalinskih miopatija, obje nemalinske miopatije odvajaju tipizaciju MYH vlakana od metabolizma skeletnih mišićnih vlakana prema bržem i manje oksidativnom mišićnom proteomu.
Ćelijska heterogenost je ključna da bi tkiva zadovoljila svoje raznolike potrebe. U skeletnim mišićima, ovo se često opisuje kao tipovi vlakana karakterizirani različitim stepenima proizvodnje sile i zamora. Međutim, jasno je da to objašnjava samo mali dio varijabilnosti vlakana skeletnih mišića, koja je mnogo varijabilnija, složenija i višestrukija nego što se ranije mislilo. Tehnološki napredak sada je bacio svjetlo na faktore koji regulišu vlakna skeletnih mišića. Zaista, naši podaci sugeriraju da vlakna tipa 2X možda nisu zaseban podtip vlakana skeletnih mišića. Štaviše, identificirali smo metaboličke proteine, ribosomske proteine i proteine povezane sa ćelijama kao glavne determinante heterogenosti vlakana skeletnih mišića. Primjenom našeg proteomskog toka rada na uzorke pacijenata s miopatijom nematoda, dodatno smo pokazali da tipizacija vlakana zasnovana na MYH ne odražava u potpunosti heterogenost skeletnih mišića, posebno kada je sistem poremećen. Zaista, bez obzira na tip vlakana zasnovan na MYH, miopatija nematoda rezultira pomakom prema bržim i manje oksidativnim vlaknima.
Skeletna mišićna vlakna se klasifikuju od 19. vijeka. Nedavne omics analize su nam omogućile da počnemo razumijevati profile ekspresije različitih tipova MYH vlakana i njihove odgovore na različite stimuluse. Kao što je ovdje opisano, omics pristupi također imaju prednost veće osjetljivosti za kvantifikaciju markera tipa vlakana u odnosu na tradicionalne metode zasnovane na antitijelima, bez oslanjanja na kvantifikaciju jednog (ili nekoliko) markera za definiranje tipa vlakna skeletnih mišića. Koristili smo komplementarne transkriptomske i proteomske tokove rada i integrirali rezultate kako bismo ispitali transkripcijsku i posttranskripcijsku regulaciju heterogenosti vlakana u ljudskim skeletnim mišićnim vlaknima. Ovaj tok rada rezultirao je neuspjehom u identifikaciji čistih vlakana 2X tipa na nivou proteina u vastus lateralisu naše kohorte zdravih mladića. Ovo je u skladu s prethodnim studijama pojedinačnih vlakana koje su pronašle <1% čistih 2X vlakana u zdravom vastus lateralisu, iako bi to trebalo biti potvrđeno i u drugim mišićima u budućnosti. Razlika između detekcije gotovo čistih 2X vlakana na nivou mRNA i samo mješovitih 2A/2X vlakana na nivou proteina je zbunjujuća. Ekspresija mRNA izoforme MYH nije cirkadijalna,67 što sugerira da je malo vjerovatno da smo "propustili" signal početka MYH2 u naizgled čistim 2X vlaknima na nivou RNK. Jedno moguće objašnjenje, iako čisto hipotetičko, mogle bi biti razlike u stabilnosti proteina i/ili mRNA između MYH izoformi. Zaista, nijedno brzo vlakno nije 100% čisto ni za jednu MYH izoformu, i nije jasno da li bi nivoi ekspresije mRNA MYH1 u rasponu od 70-90% rezultirali jednakom količinom MYH1 i MYH2 na nivou proteina. Međutim, kada se razmatra cijeli transkriptom ili proteom, klaster analiza može sa sigurnošću identificirati samo dva različita klastera koji predstavljaju spora i brza vlakna skeletnih mišića, bez obzira na njihov precizan sastav MYH. Ovo je u skladu s analizama koje koriste transkriptomske pristupe s jednom jezgrom, koji obično identificiraju samo dva različita mionuklearna klastera. 68, 69, 70 Nadalje, iako su prethodne proteomske studije identificirale vlakna tipa 2X, ova vlakna se ne grupiraju odvojeno od ostatka brzih vlakana i pokazuju samo mali broj različito obilnih proteina u usporedbi s drugim tipovima vlakana na temelju MYH-a. 14 Ovi rezultati sugeriraju da bismo se trebali vratiti na pogled na klasifikaciju mišićnih vlakana s početka 20. stoljeća, koji je dijelio ljudska skeletna mišićna vlakna ne u tri različite klase na temelju MYH-a, već u dva klastera na temelju njihovih metaboličkih i kontraktilnih svojstava. 63
Što je još važnije, heterogenost miofibera treba posmatrati u više dimenzija. Prethodne „omics“ studije su ukazivale u ovom smjeru, sugerirajući da vlakna skeletnih mišića ne formiraju diskretne klastere, već su raspoređena duž kontinuuma. 11, 13, 14, 64, 71 Ovdje pokazujemo da se, pored razlika u kontraktilnim i metaboličkim svojstvima skeletnih mišića, miofiberi mogu razlikovati po karakteristikama povezanim sa interakcijama ćelija i mehanizmima translacije. Zaista, pronašli smo heterogenost ribosoma u vlaknima skeletnih mišića koja doprinosi heterogenosti nezavisno od sporih i brzih tipova vlakana. Osnovni uzrok ove značajne heterogenosti miofibera, nezavisno od sporih i brzih tipova vlakana, ostaje nejasan, ali može ukazivati na specijaliziranu prostornu organizaciju unutar mišićnih snopića koja optimalno reaguje na specifične sile i opterećenja,72 specijaliziranu ćelijsku ili organ-specifičnu komunikaciju s drugim tipovima ćelija u mišićnom mikrookruženju73,74,75 ili razlike u aktivnosti ribosoma unutar pojedinačnih miofibera. Zaista, pokazalo se da je ribosomska heteroplazmija, bilo putem paralogne supstitucije RPL3 i RPL3L ili na nivou 2'O-metilacije rRNA, povezana sa hipertrofijom skeletnih mišića76,77. Multi-omske i prostorne primjene u kombinaciji s funkcionalnom karakterizacijom pojedinačnih miofibera dodatno će unaprijediti naše razumijevanje mišićne biologije na multi-omskom nivou78.
Analizirajući proteome pojedinačnih miofibera kod pacijenata s nemalinskim miopatijama, također smo pokazali korisnost, učinkovitost i primjenjivost proteomike pojedinačnih miofibera u razjašnjavanju kliničke patofiziologije skeletnih mišića. Štaviše, upoređujući naš tijek rada s globalnom proteomskom analizom, uspjeli smo pokazati da proteomika pojedinačnih miofibera daje istu dubinu informacija kao i globalna proteomika tkiva i proširuje tu dubinu uzimajući u obzir heterogenost među vlaknima i tip miofibera. Pored očekivanih (iako varijabilnih) razlika u omjeru tipova vlakana uočenih kod ACTA1 i TNNT1 nemalinskih miopatija u poređenju sa zdravim kontrolama,19 također smo uočili oksidativno i ekstracelularno remodeliranje neovisno o promjeni tipova vlakana posredovanoj MYH-om. Fibroza je prethodno zabilježena kod TNNT1 nemalinskih miopatija.19 Međutim, naša analiza se nadovezuje na ovaj nalaz otkrivajući i povećane nivoe ekstracelularno izlučenih proteina povezanih sa stresom, kao što su aneksini, uključeni u mehanizme popravke sarkoleme, u miofibrilama pacijenata sa ACTA1 i TNNT1 nemalinskim miopatijama.57,58,59 Zaključno, povećani nivoi aneksina u miofibrilama pacijenata sa nemalinskom miopatijom mogu predstavljati ćelijski odgovor za popravak teško atrofičnih miofibrila.
Iako ova studija predstavlja najveću analizu omike cijelog mišića kod ljudi do danas, ona nije bez ograničenja. Izolovali smo vlakna skeletnih mišića iz relativno malog i homogenog uzorka učesnika i jednog mišića (vastus lateralis). Stoga je nemoguće isključiti postojanje specifičnih populacija vlakana u različitim tipovima mišića i na ekstremnim nivoima mišićne fiziologije. Na primjer, ne možemo isključiti mogućnost pojave podskupa ultrabrzih vlakana (npr. čista 2X vlakna) kod visoko obučenih sprintera i/ili sportista snage79 ili tokom perioda mišićne neaktivnosti66,80. Nadalje, ograničena veličina uzorka učesnika spriječila nas je da istražimo spolne razlike u heterogenosti vlakana, jer je poznato da se omjeri tipova vlakana razlikuju kod muškaraca i žena. Nadalje, nismo bili u mogućnosti provesti transkriptomske i proteomske analize na istim mišićnim vlaknima ili uzorcima od istih učesnika. Kako mi i drugi nastavljamo optimizirati analize pojedinačnih ćelija i pojedinačnih miofibera koristeći omics analizu kako bismo postigli ultra-nizak ulazni uzorak (kao što je ovdje demonstrirano u analizi vlakana pacijenata s mitohondrijalnom miopatijom), postaje očigledna mogućnost kombiniranja multi-omics (i funkcionalnih) pristupa unutar pojedinačnih mišićnih vlakana.
Sveukupno, naši podaci identificiraju i objašnjavaju transkripcijske i posttranskripcijske pokretače heterogenosti skeletnih mišića. Konkretno, predstavljamo podatke koji osporavaju dugogodišnju dogmu u fiziologiji skeletnih mišića povezanu s klasičnom definicijom tipova vlakana zasnovanom na MYH. Nadamo se da ćemo obnoviti debatu i konačno preispitati naše razumijevanje klasifikacije i heterogenosti vlakana skeletnih mišića.
Četrnaest učesnika bijele rase (12 muškaraca i 2 žene) dobrovoljno je pristalo da učestvuje u ovoj studiji. Studiju je odobrio Etički komitet Univerzitetske bolnice u Gentu (BC-10237), u skladu je s Helsinškom deklaracijom iz 2013. godine i registrovana je na ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Opšte karakteristike učesnika prikazane su u Dodatnoj tabeli 1. Nakon dobijanja usmenog i pismenog informiranog pristanka, učesnici su podvrgnuti ljekarskom pregledu prije konačnog uključivanja u studiju. Učesnici su bili mladi (22–42 godine), zdravi (bez zdravstvenih problema, bez historije pušenja) i umjereno fizički aktivni. Maksimalna potrošnja kisika određena je pomoću step ergometra za procjenu fizičke spremnosti kao što je prethodno opisano. 81
Uzorci biopsije mišića prikupljeni su u mirovanju i natašte tri puta, u razmaku od 14 dana. Budući da su ovi uzorci prikupljeni kao dio veće studije, učesnici su konzumirali placebo (laktozu), antagonist H1-receptora (540 mg feksofenadina) ili antagonist H2-receptora (40 mg famotidina) 40 minuta prije biopsije. Prethodno smo pokazali da ovi antagonisti histaminskih receptora ne utiču na fizičku spremu skeletnih mišića u mirovanju81, a u našim dijagramima kontrole kvaliteta nije uočeno grupisanje povezano sa stanjem (Dopunske slike 3 i 6). Standardizovana ishrana (41,4 kcal/kg tjelesne težine, 5,1 g/kg tjelesne težine ugljikohidrata, 1,4 g/kg tjelesne težine proteina i 1,6 g/kg tjelesne težine masti) održavana je 48 sati prije svakog eksperimentalnog dana, a standardizovani doručak (1,5 g/kg tjelesne težine ugljikohidrata) konzumiran je ujutro eksperimentalnog dana. Pod lokalnom anestezijom (0,5 ml 1% lidokaina bez adrenalina), biopsije mišića su dobijene iz mišića vastus lateralis perkutanom Bergströmovom aspiracijom.82 Uzorci mišića su odmah ugrađeni u RNAlater i pohranjeni na 4°C do ručne disekcije vlakana (do 3 dana).
Svježe izolirani snopovi miofibera prebačeni su u svježi RNAlater medij u posudi za kulturu. Pojedinačna miofibera su zatim ručno disecirana pomoću stereomikroskopa i fine pincete. Dvadeset pet vlakana je disecirano iz svake biopsije, uz posebnu pažnju posvećenu odabiru vlakana iz različitih područja biopsije. Nakon disekcije, svako vlakno je nježno uronjeno u 3 μl pufera za lizu (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) koji sadrži proteinazu K i enzime DNase kako bi se uklonili neželjeni proteini i DNK. Liza ćelija i uklanjanje proteina/DNK zatim su započeto kratkim vrtloženjem, centrifugiranjem tekućine u mikrocentrifugi i inkubacijom na sobnoj temperaturi (10 minuta). Lizat je zatim inkubiran u termalnom cikleru (T100, Bio-Rad) na 37°C tokom 5 minuta, 75°C tokom 5 minuta, a zatim odmah pohranjen na -80°C do daljnje obrade.
Illumina-kompatibilne poliadenilirane RNK biblioteke pripremljene su iz 2 µl lizata miofibera korištenjem QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Detaljne metode mogu se pronaći u uputstvu proizvođača. Proces počinje sintezom cDNK prvog lanca reverznom transkripcijom, tokom koje se unose jedinstveni molekularni identifikatori (UMI) i i1 barkodovi specifični za uzorak kako bi se osiguralo objedinjavanje uzoraka i smanjila tehnička varijabilnost tokom naknadne obrade. cDNK iz 96 miofibera se zatim objedinjuje i pročišćava magnetnim kuglicama, nakon čega se RNK uklanja i vrši se sinteza drugog lanca korištenjem nasumičnih primera. Biblioteka se pročišćava magnetnim kuglicama, dodaju se i5/i7 oznake specifične za pool i PCR amplificira. Posljednji korak pročišćavanja proizvodi Illumina-kompatibilne biblioteke. Kvalitet svakog poola biblioteka procijenjen je korištenjem High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Na osnovu kvantifikacije Qubit-a, uzorci su dalje objedinjeni pri ekvimolarnim koncentracijama (2 nM). Dobiveni uzorci su zatim sekvencirani na instrumentu NovaSeq 6000 u standardnom režimu korištenjem NovaSeq S2 Reagent Kit-a (1 × 100 nukleotida) sa 2 nM punjenjem (4% PhiX).
Naš cjevovod se zasniva na Lexogenovom QuantSeq Pool cjevovodu za analizu podataka (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Podaci su prvo demultipleksirani pomoću bcl2fastq2 (v2.20.0) na osnovu i7/i5 indeksa. Očitavanje 2 je zatim demultipleksirano pomoću idemux (v0.1.6) na osnovu i1 barkoda uzorka, a UMI sekvence su ekstrahovane pomoću umi_tools (v1.0.1). Očitavanja su zatim skraćena pomoću cutadapt (v3.4) u više rundi kako bi se uklonili kratki očitavanja (dužine <20) ili očitavanja koja se sastoje isključivo od adapterskih sekvenci. Očitavanja su zatim poravnata s ljudskim genomom pomoću STAR (v2.6.0c), a BAM datoteke su indeksirane pomoću SAMtools (v1.11). Duplikati očitavanja su uklonjeni pomoću umi_tools (v1.0.1). Konačno, brojanje poravnanja je izvršeno pomoću featureCounts u Subread (v2.0.3). Kontrola kvalitete provedena je korištenjem FastQC-a (v0.11.9) u nekoliko međufaza cjevovoda.
Sva daljnja bioinformatička obrada i vizualizacija izvršene su u R (v4.2.3), prvenstveno korištenjem Seurat (v4.4.0) radnog toka. 83 Stoga su pojedinačne UMI vrijednosti i matrice metapodataka transformirane u Seurat objekte. Geni eksprimirani u manje od 30% svih vlakana su uklonjeni. Uzorci niskog kvaliteta su uklonjeni na osnovu minimalnog praga od 1000 UMI vrijednosti i 1000 detektovanih gena. Konačno, 925 vlakana je prošlo sve korake filtriranja kontrole kvaliteta. UMI vrijednosti su normalizovane korištenjem Seurat SCTransform v2 metode, 84 uključujući svih 7418 detektovanih karakteristika, a razlike između učesnika su regresirano eliminisane. Svi relevantni metapodaci mogu se naći u Dodatnom skupu podataka 28.
Vrijeme objave: 10. septembar 2025.