Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje rezultate, preporučujemo da koristite noviju verziju preglednika (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stiliziranja ili JavaScripta.
Rast mikroba u ranama često se manifestira kao biofilmovi, koji ometaju zacjeljivanje i teško ih je iskorijeniti. Novi srebrni zavoji tvrde da se bore protiv infekcija rana, ali njihova učinkovitost u borbi protiv biofilma i efekti zacjeljivanja neovisni o infekciji uglavnom su nepoznati. Koristeći in vitro i in vivo modele biofilma Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, izvještavamo o učinkovitosti zavoja koji generiraju Ag1+ ione; Ag1+ zavoja koji sadrže etilendiamintetrasirćetnu kiselinu i benzetonijum hlorid (Ag1+/EDTA/BC), te zavoja koji sadrže srebro nitrat (Ag oksisoli), koji proizvode Ag1+, Ag2+ i Ag3+ ione za borbu protiv biofilma rane i njegovog utjecaja na zacjeljivanje. Ag1+ zavoji imali su minimalne učinke na biofilm rane in vitro i kod miševa (C57BL/6j). Nasuprot tome, oksigenirane Ag soli i Ag1+/EDTA/BC zavoji značajno su smanjili broj održivih bakterija u biofilmovima in vitro i pokazali značajno smanjenje bakterijskih i EPS komponenti u biofilmovima rana miševa. Ovi zavoji imali su različite efekte na zacjeljivanje rana inficiranih biofilmom i onih koje nisu inficirane biofilmom, pri čemu su zavoji s oksigeniranom soli imali povoljnije efekte na reepitelizaciju, veličinu rane i upalu u poređenju s kontrolnim tretmanima i drugim zavojima sa srebrom. Različita fizičko-hemijska svojstva zavoja sa srebrom mogu imati različite efekte na biofilm rane i zacjeljivanje, i to treba uzeti u obzir pri odabiru zavoja za liječenje rana inficiranih biofilmom.
Hronične rane se definišu kao „rane koje ne prolaze kroz normalne faze zacjeljivanja na uredan i pravovremen način“1. Hronične rane stvaraju psihološki, socijalni i ekonomski teret za pacijente i zdravstveni sistem. Godišnja potrošnja NHS-a na liječenje rana i povezanih komorbiditeta procjenjuje se na 8,3 milijarde funti u periodu 2017–20182. Hronične rane su također trenutno gorući problem u Sjedinjenim Državama, a Medicare procjenjuje godišnje troškove liječenja pacijenata s ranama na 28,1–96,8 milijardi dolara3.
Infekcija je glavni faktor koji sprečava zacjeljivanje rana. Infekcije se često manifestuju kao biofilmovi, koji su prisutni u 78% hroničnih rana koje ne zacjeljuju. Biofilmovi nastaju kada mikroorganizmi postanu nepovratno vezani za površine, poput površina rana, i mogu se agregirati i formirati zajednice koje proizvode ekstracelularne polimere (EPS). Biofilm rane povezan je sa povećanim upalnim odgovorom koji dovodi do oštećenja tkiva, što može odgoditi ili spriječiti zacjeljivanje4. Povećanje oštećenja tkiva može biti dijelom posljedica povećane aktivnosti matriks metaloproteinaza, kolagenaze, elastaze i reaktivnih vrsta kisika5. Štaviše, upalne ćelije i biofilmovi su sami po sebi veliki potrošači kisika i stoga mogu uzrokovati lokalnu hipoksiju tkiva, iscrpljujući ćelije vitalnim kisikom potrebnim za efikasnu popravku tkiva6.
Zreli biofilmovi su vrlo otporni na antimikrobna sredstva, što zahtijeva agresivne strategije za kontrolu infekcija biofilma, kao što je mehanički tretman nakon kojeg slijedi efikasan antimikrobni tretman. Budući da se biofilmovi mogu brzo regenerirati, efikasni antimikrobni lijekovi mogu smanjiti rizik od ponovnog formiranja nakon hirurškog debridementa7.
Srebro se sve više koristi u antimikrobnim zavojima i često se koristi kao prva linija liječenja za kronično inficirane rane. Postoji mnogo komercijalno dostupnih srebrnih zavoja, od kojih svaki sadrži drugačiji sastav, koncentraciju i osnovnu matricu srebra. Napredak u srebrnim zavojima doveo je do razvoja novih srebrnih zavoja. Metalni oblik srebra (Ag0) je inertan; da bi se postigla antimikrobna učinkovitost, mora izgubiti elektron da bi se formiralo ionsko srebro (Ag1+). Tradicionalni srebrni zavoji sadrže spojeve srebra ili metalno srebro koji se, kada su izloženi tekućini, razgrađuju i formiraju Ag1+ ione. Ovi Ag1+ ioni reagiraju s bakterijskom ćelijom, uklanjajući elektrone iz strukturnih komponenti ili kritičnih procesa potrebnih za preživljavanje. Patentirana tehnologija dovela je do razvoja novog spoja srebra, Ag oksisoli (srebro nitrat, Ag7NO11), koji se uključuje u zavoje za rane. Za razliku od tradicionalnog srebra, razgradnja soli koje sadrže kisik proizvodi stanja srebra s višom valencijom (Ag1+, Ag2+ i Ag3+). In vitro studije su pokazale da su niske koncentracije oksigeniranih srebrnih soli efikasnije od jednojonskog srebra (Ag1+) protiv patogenih bakterija kao što su Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Escherichia coli8,9. Druga nova vrsta srebrnog zavoja uključuje dodatne sastojke, i to etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA) i benzetonijum hlorid (BC), za koje se navodi da ciljaju EPS biofilm i time povećavaju prodiranje srebra u biofilm. Ove nove tehnologije srebra nude nove načine ciljanja biofilmova rana. Međutim, utjecaj ovih antimikrobnih sredstava na okruženje rane i zacjeljivanje neovisno o infekciji važan je kako bi se osiguralo da ne stvaraju nepovoljno okruženje rane ili ne odgađaju zacjeljivanje. Zabrinutost zbog citotoksičnosti srebra in vitro prijavljena je kod nekoliko srebrnih zavoja10,11. Međutim, citotoksičnost in vitro još se nije pretvorila u toksičnost in vivo, a nekoliko Ag1+ zavoja pokazalo je dobar sigurnosni profil12.
Ovdje smo istražili učinkovitost karboksimetilceluloznih zavoja koji sadrže nove formulacije srebra protiv biofilma rana in vitro i in vivo. Osim toga, procijenjeni su učinci ovih zavoja na imunološki odgovor i zacjeljivanje neovisno o infekciji.
Svi korišteni zavoji bili su komercijalno dostupni. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, UK) je neantimikrobni zavoj od 100% karboksimetilceluloznih (CMC) gel vlakana koji je korišten kao kontrolni zavoj u ovoj studiji. Procijenjena su tri antimikrobna CMC srebrna zavoja, i to 3M Kerracel Ag zavoj (3M, Knutsford, UK), koji sadrži 1,7 težinskih % oksigenirane srebrne soli (Ag7NO11) u ionima srebra više valencije (Ag1+, Ag2+ i Ag3+). Tokom razgradnje Ag7NO11, Ag1+, Ag2+ i Ag3+ ioni se formiraju u omjeru 1:2:4. Aquacel Ag Extra oblog koji sadrži 1,2% srebro-hlorida (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, UK) 13 i Aquacel Ag + Extra oblog koji sadrži 1,2% srebro-hlorida (Ag1+), EDTA i benzetonijum-hlorid (ConvaTec, Deeside, UK) 14.
Sojevi korišteni u ovoj studiji bili su Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) i Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterije su uzgajane preko noći u Muller-Hinton bujonu (Oxoid, Altrincham, UK). Kultura uzgajana preko noći je zatim razrijeđena 1:100 u Mueller-Hinton bujonu i 200 µl nasađeno na sterilne 0,2 µm Whatman cyclopore membrane (Whatman plc, Maidstone, UK) na Mueller-Hinton agar ploče (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Velika Britanija). Formiranje kolonijalnog biofilma na 37°C tokom 24 sata. Ovi kolonijalni biofilmovi su testirani na logaritamsko skupljanje.
Izrežite zavoj na kvadratne komade od 3 cm2 i prethodno navlažite sterilnom deioniziranom vodom. Stavite zavoj preko biofilma kolonije na agar ploči. Svakih 24 ha biofilma je uklonjeno, a održive bakterije unutar biofilma (CFU/ml) su kvantificirane serijskim razrjeđivanjem (10−1 do 10−7) u neutralizacijskom bujonu Day-Angle (Merck-Millipore). Nakon 24 sata inkubacije na 37°C, izvršeno je standardno brojanje na pločama na Mueller-Hinton agar pločama. Svaki tretman i vremenska tačka su provedeni u tri primjerka, a brojanje na pločama je ponovljeno za svako razrjeđenje.
Koža svinjskog trbuha dobijena je od ženki velikih bijelih svinja u roku od 15 minuta od klanja u skladu s izvoznim standardima Europske unije. Koža je obrijana i očišćena alkoholnim maramicama, a zatim zamrznuta na -80°C tokom 24 sata radi devitalizacije kože. Nakon odmrzavanja, komadići kože od 1 cm2 isprani su tri puta s PBS-om, 0,6% natrijum hipohloritom i 70% etanolom po 20 minuta svaki put. Prije uklanjanja epiderme, uklonite preostali etanol ispiranjem 3 puta u sterilnom PBS-u. Koža je kultivirana na ploči sa 6 jažica s najlonskom membranom debljine 0,45 μm (Merck-Millipore) na vrhu i 3 upijajuća jastučića (Merck-Millipore) koji sadrže 3 ml fetalnog goveđeg seruma (Sigma) dopunjenog sa 10% Dulbecco's modificiranog Eagle medija (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Koloniji biofilmovi su uzgajani kako je opisano za studije izloženosti biofilmu. Nakon kultiviranja biofilma na membrani tokom 72 sata, biofilm je nanesen na površinu kože pomoću sterilne inokulacijske petlje, a zatim je membrana uklonjena. Biofilm je zatim inkubiran na dermisu svinje dodatnih 24 sata na 37°C kako bi se biofilmu omogućilo da sazrije i prilijepi se za kožu svinje. Nakon što je biofilm sazrio i pričvrstio se, zavoj od 1,5 cm2, prethodno navlažen sterilnom destiliranom vodom, nanesen je direktno na površinu kože i inkubiran na 37°C tokom 24 sata. Viable bakterije su vizualizirane bojenjem ravnomjernim nanošenjem PrestoBlue reagensa za vijabilnost ćelija (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) na apikalnu površinu svakog eksplantata i inkubacijom tokom 5 minuta. Koristite digitalnu kameru Leica DFC425 za trenutno snimanje slika na mikroskopu Leica MZ8. Područja obojena ružičastom bojom kvantificirana su korištenjem softvera Image Pro verzije 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Skenirajuća elektronska mikroskopija provedena je kao što je opisano u nastavku.
Bakterije uzgajane preko noći razrijeđene su u omjeru 1:100 u Mueller-Hintonovom bujonu. 200 μl kulture dodano je na sterilnu 0,2 μm Whatman cyclopore membranu (Whatman, Maidstone, UK) i nasađeno na Mueller-Hinton agar. Ploče s biofilmom inkubirane su na 37°C tokom 72 sata kako bi se omogućilo formiranje zrelog biofilma.
Nakon 3 dana sazrijevanja biofilma, kvadratni zavoj površine 3 cm2 postavljen je direktno na biofilm i inkubiran na 37°C tokom 24 sata. Nakon uklanjanja zavoja sa površine biofilma, na površinu svakog biofilma dodat je 1 ml PrestoBlue reagensa za vijabilnost ćelija (Invitrogen, Waltham, MA) tokom 20 sekundi. Površine su osušene prije nego što su promjene boje zabilježene pomoću digitalnog fotoaparata Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, UK).
Pripremite kulture uzgajane preko noći na Mueller-Hinton agaru, prebacite pojedinačne kolonije u 10 ml Mueller-Hinton bujona i inkubirajte na mućkalici na 37°C (100 rpm). Nakon inkubacije preko noći, kultura je razrijeđena 1:100 u Mueller-Hinton bujonu i 300 µl je naneseno na kružnu Whatman ciklopornu membranu od 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, UK) na Mueller-Hinton agaru i inkubirano na 37°C unutar 72 sata. Zreli biofilm je nanesen na ranu kao što je opisano u nastavku.
Sav rad sa životinjama proveden je na Univerzitetu u Manchesteru u skladu s projektnom licencom koju je odobrio Ured za dobrobit životinja i etičku reviziju (P8721BD27) i u skladu sa smjernicama koje je objavilo Ministarstvo unutrašnjih poslova u skladu s revidiranim ASPA-om iz 2012. godine. Svi autori su se pridržavali smjernica za dolazak. Osam sedmica stari C57BL/6j miševi (Envigo, Oxon, UK) korišteni su za sve in vivo studije. Miševi su anestezirani izofluranom (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, UK), a njihove dorzalne površine su obrijane i očišćene. Svaki miš je zatim dobio ekscizijsku ranu veličine 2 × 6 mm pomoću Stiefel biopsijskog bušača (Schuco International, Hertfordshire, UK). Za rane inficirane biofilmom, nanesite 72-satni kolonijalni biofilm uzgojen na membrani kao što je gore opisano na dermalni sloj rane pomoću sterilne inokulacijske petlje odmah nakon povrede i odbacite membranu. Jedan kvadratni centimetar zavoja prethodno je navlažen sterilnom vodom kako bi se održalo vlažno okruženje rane. Zavoji su direktno naneseni na svaku ranu i prekriveni 3M Tegaderm filmom (3M, Bracknell, UK) i Mastisol tekućim ljepilom (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) nanesenim oko rubova radi dodatnog prianjanja. Buprenorfin (Animalcare, York, UK) je primijenjen u koncentraciji od 0,1 mg/kg kao analgetik. Miševi su ubijeni tri dana nakon povrede koristeći metodu iz Rasporeda 1 i područje rane je po potrebi uklonjeno, prepolovljeno i pohranjeno.
Bojenje hematoksilinom (ThermoFisher Scientific) i eozinom (ThermoFisher Scientific) provedeno je prema protokolu proizvođača. Površina rane i reepitelizacija kvantificirane su korištenjem softvera Image Pro verzije 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Presjeci tkiva su deparafinirani u ksilenu (ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK), rehidrirani sa 100-50% etanolom i nakratko uronjeni u deioniziranu vodu (ThermoFisher Scientific). Imunohistokemija je provedena korištenjem VectaStain Elite ABC PK-6104 kita (Vector Laboratories, Burlingame, CA) prema protokolu proizvođača. Primarna antitijela na neutrofile NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) i makrofage Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) su razrijeđena 1:100 u rastvoru za blokiranje i dodana na površinu reza, nakon čega su dodana 2 antitijela Anti-, VectaStain ABC i Vector Nova Red Peroxidase (HRP) supstrat kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i kontrastno obojena hematoksilinom. Slike su snimljene pomoću mikroskopa Olympus BX43 i digitalnog fotoaparata Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, UK).
Uzorci kože fiksirani su u 2,5% glutaraldehidu i 4% formaldehidu u 0,1 M HEPES-u (pH 7,4) tokom 24 sata na 4°C. Uzorci su dehidrirani korištenjem graduiranog etanola i sušeni u CO2 korištenjem Quorum K850 sušilice kritičnih tačaka (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) te naprašivani legurom zlata i paladija korištenjem Quorum SC7620 mini sistema za raspršivanje/tijenjeno pražnjenje. Uzorci su snimljeni korištenjem FEI Quanta 250 skenirajućeg elektronskog mikroskopa (ThermoFisher Scientific) kako bi se vizualizirala centralna tačka rane.
Toto-1 jodid (2 μM) je nanesen na izrezanu površinu rane miša i inkubiran 5 minuta na 37 °C (ThermoFisher Scientific) te tretiran sa Syto-60 (10 μM) na 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15-minutne Z-stack slike su kreirane pomoću Leica TCS SP8.
Biološki i tehnički podaci o ponovljenim uzorcima su tabelarno prikazani i analizirani korištenjem Graphpad Prism V9 softvera (GraphPad Software, La Jolla, CA). Jednosmjerna analiza varijanse s višestrukim poređenjima korištenjem Dunnettovog post hoc testa korištena je za testiranje razlika između svakog tretmana i kontrolnog zavoja bez antimikrobnih sredstava. Vrijednost p <0,05 smatrana je značajnom.
Učinkovitost vlaknastih zavoja od srebrnog gela prvo je procijenjena na kolonijama biofilma Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa in vitro. Srebrni zavoji sadrže različite formule srebra: tradicionalni srebrni zavoji proizvode Ag1+ ione; srebrni zavoji, koji mogu proizvesti Ag1+ ione nakon dodavanja EDTA/BC, mogu uništiti matricu biofilma i izložiti bakterije srebru pod antibakterijskim djelovanjem srebrnih iona15 i zavoji koji sadrže oksigenirane soli Ag koje proizvode Ag1+, Ag2+ i Ag3+ ione. Njegova učinkovitost je uspoređena s kontrolnim zavojem bez antimikrobnog djelovanja napravljenim od geliranih vlakana. Preostale održive bakterije unutar biofilma procijenjivane su svakih 24 sata tokom 8 dana (Slika 1). Petog dana, biofilm je reinokuliran sa 3,85 × 105S Staphylococcus aureus ili 1,22 × 105P. aeruginosa kako bi se procijenio oporavak biofilma. U poređenju sa kontrolnim zavojima bez antimikrobnih sastojaka, zavoji sa Ag1+ imali su minimalan uticaj na bakterijsku održivost u biofilmovima Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa tokom 5 dana. Nasuprot tome, zavoji koji sadrže oksigenirani Ag i Ag1+ + EDTA/BC soli bili su efikasni u ubijanju bakterija unutar biofilma unutar 5 dana. Nakon ponovljene inokulacije planktonskim bakterijama 5. dana, nije uočena obnova biofilma (Slika 1).
Kvantifikacija održivih bakterija u biofilmovima Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa nakon tretmana srebrnim zavojima. Kolonije biofilma Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa tretirane su srebrnim zavojima ili kontrolnim zavojima bez antimikrobnih sastojaka, a broj preostalih održivih bakterija određivan je svakih 24 sata. Nakon 5 dana, biofilm je reinokuliran sa 3,85×105S. Staphylococcus aureus ili 1,22×105P. Kolonije bakterioplanktona Pseudomonas aeruginosa formirane su pojedinačno kako bi se procijenio oporavak biofilma. Grafikoni prikazuju srednju vrijednost +/- standardnu grešku.
Kako bi se vizualizirao učinak srebrnih obloga na održivost biofilma, obloge su nanesene na zrele biofilmove uzgojene na koži svinje ex vivo. Nakon 24 sata, obloga se uklanja, a biofilm se boji plavom reaktivnom bojom, koju žive bakterije metaboliziraju u ružičastu boju. Biofilmovi tretirani kontrolnim oblogama bili su ružičasti, što ukazuje na prisustvo održivih bakterija unutar biofilma (Slika 2A). Nasuprot tome, biofilm tretiran Ag oxysols oblogom bio je prvenstveno plav, što ukazuje na to da su preostale bakterije na površini kože svinje bile neodržive bakterije (Slika 2B). Mješovita plava i ružičasta obojenost uočena je u biofilmovima tretiranim oblogama koje sadrže Ag1+, što ukazuje na prisustvo održivih i neodrživih bakterija unutar biofilma (Slika 2C), dok su EDTA/BC obloge koje sadrže Ag1+ bile pretežno plave s nekim ružičastim mrljama, što ukazuje na područja koja nisu bila pogođena srebrnim oblogom (Slika 2D). Kvantifikacija aktivnih (ružičastih) i neaktivnih (plavih) područja pokazala je da je kontrolni flaster bio 75% aktivan (Slika 2E). Ag1+ + EDTA/BC zavoji su djelovali slično kao i zavoji sa oksigeniranim Ag solima, sa stopama preživljavanja od 13% odnosno 14%. Ag1+ zavoj je također smanjio bakterijsku održivost za 21%. Ovi biofilmovi su zatim posmatrani skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM). Nakon tretmana kontrolnim zavojem i Ag1+ zavojem, uočen je sloj Pseudomonas aeruginosa koji prekriva kožu svinje (Slika 2F,H), dok je nakon tretmana Ag1+ zavojem pronađeno malo bakterijskih ćelija i malo bakterijskih ćelija ispod. Kolagena vlakna se mogu smatrati tkivnom strukturom kože svinje (Slika 2G). Nakon tretmana Ag1+ + EDTA/BC zavojem, vidljivi su bakterijski plakovi i plakovi kolagenih vlakana ispod njih (Slika 2I).
Vizualizacija biofilma Pseudomonas aeruginosa nakon tretmana srebrnim zavojem. (A–D) Bakterijska održivost u biofilmovima Pseudomonas aeruginosa uzgojenim na koži svinje vizualizirana je korištenjem boje za održivost PrestoBlue 24 sata nakon tretmana srebrnim zavojima ili kontrolnim zavojima bez antimikrobnih sastojaka. Žive bakterije su ružičaste, neodržive bakterije i koža svinje su plave. (E) Kvantifikacija biofilmova Pseudomonas aeruginosa uzgojenih na koži svinje (ružičasta mrlja) korištenjem skenirajuće elektronske mikroskopije Image Pro verzija 10 (FI) i tretiranih srebrnim zavojem ili kontrolnim zavojem bez antimikrobnih sastojaka tokom 24 sata. SEM skala = 5 µm. (J–M) Kolonijalistički biofilmovi rasli su na filterima i obojeni su reaktivnom bojom PrestoBlue nakon 24 sata inkubacije sa srebrnim zavojima.
Kako bi se utvrdilo da li bliski kontakt između zavoja i biofilmova utiče na efikasnost zavoja, kolonijalni biofilmovi postavljeni na ravnu površinu tretirani su zavojima 24 sata, a zatim obojeni reaktivnim bojama. Netretirani biofilm bio je tamno ružičaste boje (Slika 2J). Za razliku od biofilmova tretiranih zavojima koji sadrže oksigenirane Ag soli (Slika 2K), biofilmovi tretirani zavojima koji sadrže Ag1+ ili Ag1+ + EDTA/BC pokazali su trake ružičastog bojenja (Slika 2L,M). Ova ružičasta obojenost ukazuje na prisustvo održivih bakterija i povezana je sa područjem šava unutar zavoja. Ova ušivena područja stvaraju mrtve prostore koji omogućavaju bakterijama unutar biofilma da prežive.
Da bi se procijenila učinkovitost srebrnih zavoja in vivo, rane miševa zaraženih zrelim biofilmovima S. aureus i P. aeruginosa, kojima je u potpunosti izrezana rana, tretirane su kontrolnim zavojima bez antimikrobnih sastojaka ili srebrnim zavojima. Nakon 3 dana tretmana, makroskopska analiza slike pokazala je manje veličine rana kada su tretirane zavojima s oksigeniranom soli u poređenju s kontrolnim zavojima bez antimikrobnih sastojaka i drugim srebrnim zavojima (Slika 3A-H). Da bi se potvrdila ova zapažanja, rane su sakupljene, a površina rane i reepitelizacija kvantificirani su na presjecima tkiva obojenim hematoksilinom i eozinom korištenjem softvera Image Pro verzije 10 (Slika 3I-L).
Učinak srebrnih obloga na površinu rane i reepitelizacija rana inficiranih biofilmovima. (A–H) Male ćelije inficirane biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (A–D) i Staphylococcus aureus (E–H) nakon tri dana tretmana kontrolnim oblogom bez antimikrobnog djelovanja, oblogom s oksigeniranom Ag soli, oblogom s Ag1+ i oblogom s Ag1+. Reprezentativne makroskopske slike. Rane miševa s oblogom Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Reprezentativna infekcija Pseudomonas aeruginosa, histološki presjeci obojeni hematoksilinom i eozinom, korišteni za kvantifikaciju površine rane i regeneracije epitela. Kvantifikacija površine rane (M, O) i postotka reepitelizacije (N, P) rana inficiranih biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (M, N) i Staphylococcus aureus (O, P) (po grupi tretmana n = 12). Grafikoni prikazuju srednju vrijednost +/- standardnu grešku. * znači p = < 0,05 ** znači p = < 0,01; Makroskopska skala = 2,5 mm, histološka skala = 500 µm.
Kvantifikacija površine rane kod rana inficiranih biofilmom Pseudomonas aeruginosa (Slika 3M) pokazala je da su rane tretirane Ag oksisolima imale prosječnu veličinu rane od 2,5 mm2, dok je kontrolni zavoj bez antimikrobnih sastojaka imao prosječnu veličinu rane od 3,1 mm2, što nije tačno. dostigla je statističku značajnost (Slika 3M). p = 0,423). Rane tretirane sa Ag1+ ili Ag1+ + EDTA/BC nisu pokazale smanjenje površine rane (3,1 mm2 i 3,6 mm2, respektivno). Tretman zavojem sa oksigeniranom Ag solima promovisao je reepitelizaciju u većoj mjeri nego kontrolni zavoj bez antimikrobnih sastojaka (34% i 15%, respektivno; p = 0,029) i Ag1+ ili Ag1+ + EDTA/BC (10% i 11%) (Slika 3N). . , respektivno).
Slični trendovi u površini rane i regeneraciji epitela uočeni su kod rana inficiranih biofilmovima S. aureus (Slika 3O). Zavoji koji sadrže oksigenirane soli srebra smanjili su površinu rane (2,0 mm2) za 23% u poređenju s kontrolnim neantimikrobnim zavojem (2,6 mm2), iako ovo smanjenje nije bilo značajno (p = 0,304) (Slika 3O). Osim toga, površina rane u grupi tretiranoj Ag1+ bila je neznatno smanjena (2,4 mm2), dok rana tretirana Ag1+ + EDTA/BC zavojem nije smanjila površinu rane (2,9 mm2). Kisikove soli Ag također su u većoj mjeri promovirale reepitelizaciju rana inficiranih biofilmom S. aureus (31%) u odnosu na one tretirane kontrolnim zavojima bez antimikrobnih sastojaka (12%, p = 0,003) (Slika 3P). Ag1+ obloga (16%, p = 0,903) i Ag+1 + EDTA/BC obloga (14%, p = 0,965) pokazala je nivoe regeneracije epitela slične kontrolnoj grupi.
Da bi se vizualizirao učinak srebrnih zavoja na matricu biofilma, izvršeno je bojenje Toto 1 i Syto 60 jodidom (Sl. 4). Toto 1 jodid je boja nepropusna za ćelije koja se može koristiti za preciznu vizualizaciju ekstracelularnih nukleinskih kiselina, koje su obilne u EPS-u biofilmova. Syto 60 je boja propusna za ćelije koja se koristi kao kontrastna boja16. Opservacije Toto 1 i Syto 60 jodida u ranama inokuliranim biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (Slika 4A-D) i Staphylococcus aureus (Slika 4I-L) pokazale su da je nakon 3 dana tretmana zavojem, EPS u biofilmu značajno smanjen. Zavoji koji sadrže oksigenirane soli Ag i Ag1+ + EDTA/BC. Ag1+ zavoji bez dodatnih antibiotskih komponenti biofilma značajno su smanjili DNK bez ćelija u ranama inokuliranim Pseudomonas aeruginosa, ali su bili manje efikasni u ranama inokuliranim Staphylococcus aureus.
In vivo snimanje biofilma rane nakon 3 dana tretmana kontrolnim ili srebrnim zavojima. Konfokalne slike Pseudomonas aeruginosa (A–D) i Staphylococcus aureus (I–L) obojenih sa Toto 1 (zeleno) za vizualizaciju ekstracelularnih nukleinskih kiselina, komponente ekstracelularnih polimera biofilma. Za bojenje intracelularnih nukleinskih kiselina koristite Syto 60 (crveno). kiseline. P. Skenirajuća elektronska mikroskopija rana inficiranih biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (E–H) i Staphylococcus aureus (M–P) nakon 3 dana tretmana kontrolnim i srebrnim zavojima. SEM skala = 5 µm. Konfokalna skala snimanja = 50 µm.
Skenirajuća elektronska mikroskopija pokazala je da su miševi inokulirani kolonijama biofilma Pseudomonas aeruginosa (Slika 4E-H) i Staphylococcus aureus (Slika 4M-P) imali značajno manje bakterija u ranama nakon 3 dana tretmana sa svim srebrnim zavojima.
Kako bi se procijenio učinak srebrnih zavoja na upalu rana kod miševa zaraženih biofilmom, dijelovi rana zaraženih biofilmom tretiranih kontrolnim ili srebrnim zavojima tokom 3 dana imunohistokemijski su obojeni korištenjem antitijela specifičnih za neutrofile i makrofage. Kvantitativno određivanje neutrofila i makrofaga interno. granulacijsko tkivo. Slika 5). Svi srebrni zavoji smanjili su broj neutrofila i makrofaga u ranama zaraženim Pseudomonas aeruginosa u usporedbi s kontrolnim zavojima bez antimikrobnih sredstava nakon tri dana tretmana. Međutim, tretman zavojem s oksigeniranom srebrnom soli rezultirao je većim smanjenjem neutrofila (p = <0,0001) i makrofaga (p = <0,0001) u usporedbi s drugim testiranim srebrnim zavojima (Slika 5I,J). Iako je Ag1+ + EDTA/BC imao veći učinak na biofilm rane, smanjio je nivoe neutrofila i makrofaga u manjoj mjeri nego zavoj Ag1+. Umjerene rane inficirane biofilmom S. aureus također su uočene nakon previjanja s Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) i Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) oksisolima u poređenju s kontrolnom grupom. Slični trendovi uočeni su i za neutropeniju. (Slika 5K). Međutim, samo je preljev s oksigeniranom Ag soli pokazao značajno smanjenje broja makrofaga u granulacijskom tkivu u poređenju s kontrolnom grupom kod rana inficiranih biofilmovima S. aureus (p = 0,0339) (Slika 5L).
Neutrofili i makrofagi su kvantificirani u ranama inficiranim biofilmovima Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus nakon 3 dana tretmana kontrolnim zavojima bez antimikrobnih sredstava ili srebrnim zavojima. Neutrofili (AD) i makrofagi (EH) su kvantificirani u presjecima tkiva obojenim antitijelima specifičnim za neutrofile ili makrofage. Kvantifikacija neutrofila (I i K) i makrofaga (J i L) u ranama inficiranim biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (I i J) i Staphylococcus aureus (K i L). N = 12 po grupi. Grafikoni prikazuju srednju vrijednost +/- standardnu grešku, vrijednosti značajnosti u poređenju sa kontrolnim zavojem bez antibakterijskih sredstava, * znači p = < 0,05, ** znači p = < 0,01; *** znači p = < 0,001; označava p = < 0,0001).
Zatim smo procijenili učinak srebrnih zavoja na zacjeljivanje neovisno o infekciji. Neinficirane ekscizijske rane tretirane su kontrolnim zavojem bez antimikrobnog djelovanja ili srebrnim zavojem tokom 3 dana (Slika 6). Među testiranim srebrnim zavojima, samo su rane tretirane zavojem s oksigeniranom soli izgledale manje na makroskopskim slikama od rana tretiranih kontrolnom grupom (Slika 6A-D). Kvantifikacija površine rane pomoću histološke analize pokazala je da je prosječna površina rane nakon tretmana zavojem s Ag oxysols bila 2,35 mm2 u poređenju s 2,96 mm2 za rane tretirane kontrolnom grupom, ali ova razlika nije dostigla statističku značajnost (p = 0,488) (Slika 6I). Nasuprot tome, nije uočeno smanjenje površine rane nakon tretmana zavojima s Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) ili Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) u poređenju s kontrolnom grupom. Povećana regeneracija epitela uočena je kod zavoja s Ag oxysolom u poređenju s kontrolnom grupom (30% prema 22%, respektivno), iako ovo nije dostiglo statističku značajnost (p = 0,067), što je prilično značajno i potvrđuje prethodne rezultate. Zavoj s oxysolima potiče reepitelizaciju. -Epitelizacija neinficiranih rana17. Nasuprot tome, tretman zavojima s Ag1+ ili Ag1+ + EDTA/BC nije imao učinka ili je pokazao smanjenu reepitelizaciju u poređenju s kontrolnom grupom.
Učinak srebrnog zavoja za rane na zacjeljivanje rana kod neinficiranih miševa s potpunom resekcijom. (AD) Reprezentativne makroskopske slike rana nakon tri dana tretmana kontrolnim zavojem bez antimikrobnih sastojaka i srebrnim zavojem. (EH) Reprezentativni presjeci rana obojeni hematoksilinom i eozinom. Kvantifikacija površine rane (I) i postotak reepitelizacije (J) izračunati su iz histoloških presjeka na sredini rane korištenjem softvera za analizu slika (n = 11–12 po grupi tretmana). Grafikoni prikazuju srednju vrijednost +/- standardnu grešku. * znači p = <0,05.
Srebro ima dugu istoriju upotrebe kao antimikrobna terapija u zacjeljivanju rana, ali mnoge različite formulacije i metode isporuke mogu rezultirati razlikama u antimikrobnoj efikasnosti 18. Štaviše, svojstva antibiofilma specifičnih sistema za isporuku srebra nisu u potpunosti shvaćena. Iako je imunološki odgovor domaćina relativno efikasan protiv planktonskih bakterija, generalno je manje efikasan protiv biofilmova 19. Planktonske bakterije se lako fagocitiraju makrofagima, ali unutar biofilmova, agregirane ćelije predstavljaju dodatne probleme ograničavajući odgovor domaćina do te mjere da imunološke ćelije mogu proći kroz apoptozu i osloboditi proinflamatorne faktore kako bi pojačale imunološki odgovor 20. Primijećeno je da neki leukociti mogu prodrijeti kroz biofilmove 21, ali nisu u stanju fagocitirati bakterije kada je ova odbrana ugrožena 22. Treba koristiti holistički pristup kako bi se podržao imunološki odgovor domaćina protiv infekcije biofilma rane. Debridement rane može fizički poremetiti biofilm i ukloniti većinu bioopterećenja, ali imunološki odgovor domaćina može biti neefikasan protiv preostalog biofilma, posebno ako je imunološki odgovor domaćina ugrožen. Dakle, antimikrobne terapije poput srebrnih obloga mogu podržati imunološki odgovor domaćina i eliminirati infekcije biofilma. Sastav, koncentracija, topljivost i supstrat za isporuku mogu utjecati na antimikrobnu učinkovitost srebra. Posljednjih godina, napredak u tehnologiji obrade srebra učinio je ove obloge učinkovitijima9,23. Kako tehnologija srebrnih obloga napreduje, važno je razumjeti učinkovitost ovih obloga u kontroli infekcije rane i, što je još važnije, utjecaj ovih potentnih oblika srebra na okolinu rane i zacjeljivanje.
U ovoj studiji, uporedili smo efikasnost dva napredna srebrna zavoja sa konvencionalnim srebrnim zavojima koji proizvode Ag1+ ione protiv biofilmova koristeći različite in vitro i in vivo modele. Također smo procijenili učinak ovih zavoja na okruženje rane i zacjeljivanje neovisno o infekciji. Kako bi se smanjio utjecaj matrice za dostavu, svi testirani srebrni zavoji bili su sastavljeni od karboksimetilceluloze.
Naša preliminarna evaluacija ovih srebrnih obloga protiv kolonijalnih biofilmova Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus pokazuje da su, za razliku od tradicionalnih Ag1+ obloga, dvije napredne srebrne obloge, Ag1+ + EDTA/BC i oksigenirane Ag soli, učinkovite pri 5. Efikasno ubijajući bakterije biofilma u roku od nekoliko dana. Osim toga, ovi obloge sprječavaju ponovno formiranje biofilma nakon ponovljenog izlaganja planktonskim bakterijama. Ag1+ obloga sadržavala je srebro-hlorid, isti spoj srebra i osnovnu matricu kao Ag1+ + EDTA/BC, te je imala ograničen učinak na održivost bakterija unutar biofilma u istom periodu. Zapažanje da je Ag1+ + EDTA/BC obloga bila učinkovitija protiv biofilma od Ag1+ obloge koja se sastoji od iste matrice i spoja srebra podržava ideju da su potrebni dodatni sastojci za povećanje učinkovitosti srebro-hlorida protiv biofilma, kao što je već zabilježeno u drugim istraživanjima15. Ovi rezultati podržavaju ideju da BC i EDTA igraju dodatnu ulogu koja doprinosi ukupnoj efikasnosti zavoja i da je odsustvo ove komponente u Ag1+ zavojima moglo doprinijeti neuspjehu u dokazivanju efikasnosti in vitro. Otkrili smo da zavoji sa oksigeniranim Ag solima koji proizvode Ag2+ i Ag3+ ione pokazuju jaču antibakterijsku efikasnost od Ag1+ i na nivoima sličnim Ag1+ + EDTA/BC. Međutim, zbog visokog redoks potencijala, nije jasno koliko dugo Ag3+ ioni ostaju aktivni i efikasni protiv biofilmova rana i stoga zaslužuju dalja istraživanja. Pored toga, postoje mnogi različiti zavoji koji generišu Ag1+ ione koji nisu testirani u ovoj studiji. Ovi zavoji se sastoje od različitih jedinjenja srebra, koncentracija i osnovnih matrica, što može uticati na isporuku Ag1+ iona i njihovu efikasnost protiv biofilmova. Također je vrijedno napomenuti da postoje mnogi različiti in vitro i in vivo modeli koji se koriste za procjenu efikasnosti zavoja za rane protiv biofilmova. Vrsta korištenog modela, kao i sadržaj soli i proteina u mediju koji se koristi u ovim modelima, uticaće na efikasnost zavoja. U našem in vivo modelu, dozvolili smo da biofilm sazrije in vitro, a zatim smo ga prenijeli na dermalnu površinu rane. Imunološki odgovor domaćina miša je relativno efikasan protiv planktonskih bakterija nanesenih na ranu, čime se formira biofilm dok rana zacjeljuje. Dodavanje zrelog biofilma rani ograničava efikasnost imunološkog odgovora domaćina na formiranje biofilma omogućavajući zrelom biofilmu da se uspostavi unutar rane prije nego što zacjeljivanje može početi. Dakle, naš model nam omogućava da procijenimo efikasnost antimikrobnih zavoja na zrelim biofilmovima prije nego što rane počnu zacjeljivati.
Također smo otkrili da prianjanje zavoja utječe na učinkovitost srebrnih zavoja na in vitro uzgojenim biofilmovima i koži svinja. Bliski kontakt s ranom smatra se ključnim za antimikrobnu učinkovitost zavoja24,25. Zavoji koji sadrže oksigenirane Ag soli bili su u bliskom kontaktu sa zrelim biofilmovima, što je rezultiralo značajnim smanjenjem broja održivih bakterija unutar biofilma nakon 24 sata. Nasuprot tome, kada su tretirani zavojima Ag1+ i Ag1+ + EDTA/BC, značajan broj održivih bakterija je ostao. Ovi zavoji sadrže šavove duž cijele dužine zavoja, što stvara mrtve prostore koji sprječavaju bliski kontakt s biofilmom. U našim in vitro studijama, ova područja bez kontakta spriječila su ubijanje održivih bakterija unutar biofilma. Procijenili smo održivost bakterija tek nakon 24 sata tretmana; Vremenom, kako zavoj postaje zasićeniji, može biti manje mrtvog prostora, smanjujući površinu za ove održive bakterije. Međutim, ovo naglašava važnost sastava zavoja, a ne samo vrste srebra u zavoju.
Iako su in vitro studije korisne za poređenje efikasnosti različitih tehnologija srebra, važno je razumjeti i efekte ovih zavoja na biofilmove in vivo, gdje tkivo domaćina i imunološki odgovori doprinose efikasnosti zavoja protiv biofilmova. Učinak ovih zavoja na biofilmove rana posmatran je pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije i EPS bojenja biofilma korištenjem intracelularnih i ekstracelularnih DNK boja. Otkrili smo da su nakon 3 dana tretmana svi zavoji bili efikasni u smanjenju DNK bez ćelija u ranama inficiranim biofilmom, ali je Ag1+ zavoj bio manje efikasan kod rana inficiranih Staphylococcus aureusom. Skenirajuća elektronska mikroskopija je također pokazala da je značajno manje bakterija prisutno u ranama tretiranim srebrnim zavojima, iako je to bilo izraženije kod zavoja sa oksigeniranom Ag soli i Ag1+ + EDTA/BC zavoja u poređenju sa Ag1+ zavojem. Ovi podaci pokazuju da su testirani srebrni zavoji imali različit stepen uticaja na strukturu biofilma, ali nijedan od srebrnih zavoja nije bio u stanju da iskoreni biofilm, što podržava potrebu za holističkim pristupom liječenju infekcija biofilma rana; upotreba srebrnih narukvica. Tretmanu prethodi fizički debridement kako bi se uklonila većina biofilma.
Hronične rane su često u stanju teške upale, pri čemu višak upalnih ćelija ostaje u tkivu rane duži vremenski period, uzrokujući oštećenje tkiva i iscrpljujući kisik potreban za efikasan ćelijski metabolizam i funkciju u rani26. Biofilmovi pogoršavaju ovo neprijateljsko okruženje rane negativno utičući na zacjeljivanje na različite načine, uključujući inhibiciju proliferacije i migracije ćelija i aktivaciju proinflamatornih citokina27. Kako srebrni zavoji postaju sve efikasniji, važno je razumjeti njihov uticaj na okruženje rane i zacjeljivanje.
Zanimljivo je da, iako su svi srebrni zavoji utjecali na sastav biofilma, samo su zavoji sa oksidiranim srebrnim solima povećali ponovnu epitelizaciju ovih inficiranih rana. Ovi podaci podržavaju naše prethodne nalaze17 i one Kalana i suradnika (2017)28, koji su pokazali dobre profile sigurnosti i toksičnosti oksidiranih srebrnih soli, budući da su niže koncentracije srebra bile učinkovite protiv biofilmova.
Naša trenutna studija ističe razlike u tehnologiji srebra između antimikrobnih srebrnih zavoja i utjecaj ove tehnologije na okruženje rane i zacjeljivanje neovisno o infekciji. Međutim, ovi rezultati se razlikuju od prethodnih studija koje su pokazale da Ag1+ + EDTA/BC zavoj poboljšava parametre zacjeljivanja ozlijeđenih zečjih ušiju in vivo. Međutim, to može biti zbog razlika u životinjskim modelima, vremenu mjerenja i metodama primjene bakterija29. U ovom slučaju, mjerenja rane su izvršena 12 dana nakon povrede kako bi se aktivnim sastojcima zavoja omogućilo da djeluju na biofilm tokom dužeg vremenskog perioda. Ovo podržava studija koja je pokazala da su klinički inficirani čirevi na nogama tretirani sa Ag1+ + EDTA/BC u početku porasli nakon jedne sedmice liječenja, a zatim tokom sljedeće 3 sedmice liječenja sa Ag1+ + EDTA/BC i unutar 4 sedmice upotrebe lijekova koji nisu antimikrobni lijekovi. CMC zavoji za smanjenje veličine čireva30.
Prethodno je pokazano da su određeni oblici i koncentracije srebra citotoksični in vitro 11, ali ovi in vitro rezultati ne prenose uvijek na štetne efekte in vivo. Osim toga, napredak u tehnologiji srebra i bolje razumijevanje spojeva srebra i koncentracija u zavojima doveli su do razvoja mnogih sigurnih i učinkovitih srebrnih zavoja. Međutim, kako tehnologija srebrnih zavoja napreduje, važno je razumjeti utjecaj ovih zavoja na okolinu rane 31, 32, 33. Prethodno je objavljeno da povećana stopa reepitelizacije odgovara povećanom udjelu protuupalnih M2 makrofaga u usporedbi s proupalnim M1 fenotipom. Ovo je primijećeno u prethodnom modelu miša gdje su zavoji za rane od srebrnog hidrogela uspoređivani sa srebrnim sulfadiazinom i neantimikrobnim hidrogelovima 34.
Hronične rane mogu pokazivati prekomjernu upalu, a uočeno je da prisustvo viška neutrofila može biti štetno za zacjeljivanje rana35. U studiji na miševima sa smanjenim brojem neutrofila, prisustvo neutrofila odgodilo je reepitelizaciju. Prisustvo viška neutrofila dovodi do visokih nivoa proteaza i reaktivnih vrsta kisika, poput superoksida i vodikovog peroksida, koji su povezani sa hroničnim i sporo zacjeljujućim ranama37,38. Slično tome, povećanje broja makrofaga, ako se ne kontroliše, može dovesti do odgođenog zacjeljivanja rana39. Ovo povećanje je posebno važno ako makrofagi nisu u stanju da pređu iz proinflamatornog fenotipa u pro-zacjeljujući fenotip, što rezultira time da rane ne uspijevaju da izađu iz upalne faze zacjeljivanja40. Uočili smo smanjenje neutrofila i makrofaga u ranama inficiranim biofilmom nakon 3 dana tretmana svim srebrnim zavojima, ali smanjenje je bilo izraženije kod zavoja sa oksigeniranom soli. Ovo smanjenje može biti direktna posljedica imunološkog odgovora na srebro, odgovora na smanjeno biološko opterećenje ili činjenice da je rana u kasnijoj fazi zacjeljivanja, a samim tim i smanjenja broja imunoloških ćelija u rani. Smanjenje broja upalnih ćelija u rani može održavati okruženje koje pogoduje zacjeljivanju rana. Mehanizam djelovanja Ag oksisoli za zacjeljivanje neovisno o infekciji nije jasan, ali sposobnost Ag oksisoli da proizvode kisik i uništavaju štetne nivoe vodikovog peroksida, medijatora upale, može objasniti ovo i zahtijeva daljnja istraživanja17.
Hronične inficirane rane koje ne zacjeljuju predstavljaju problem i za ljekare i za pacijente. Iako mnogi zavoji tvrde da imaju antimikrobnu efikasnost, istraživanja se rijetko fokusiraju na druge ključne faktore koji utiču na mikrookruženje rane. Ova studija pokazuje da različite tehnologije srebra imaju različitu antimikrobnu efikasnost i, što je važno, različite efekte na okruženje rane i zacjeljivanje, nezavisno od infekcije. Iako ove in vitro i in vivo studije pokazuju efikasnost ovih zavoja u liječenju infekcija rana i podsticanju zacjeljivanja, potrebna su randomizirana kontrolirana ispitivanja kako bi se procijenila efikasnost ovih zavoja u klinici.
Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tokom trenutne studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Vrijeme objave: 15. juli 2024.